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Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2008 : 18:07:43
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ciao 
Sapete spiegarmi passo per passo cosa accade nella fase dello stacking gel?
So che si tratta di un gel di impaccamento posto sopra quello in cui avviene la separazione, ed ha la funzione di concentrare il campione in un unica banda prima di iniziare la corsa elettroforetica.
Non riesco a capire ciò che accade tra ioni glicinato, ioni cloruro e proteina-SDS
Grazie
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greace
Nuovo Arrivato
Città: ancona
43 Messaggi |
Inserito il - 27 giugno 2008 : 18:33:30
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ciao ho trattato questo argomento l'anno scorso...ti dico tutto quello che so e spero ti sia utile
allora la page con gel o buffer nn omogenei è costituita da 2 gel:
1. gel di impilamento o spaziatore (stacking gel pH= 6.8)
2. gel di separazione o di corsa (running gel pH= 8.8)
e da 3 buffer:
1. buffer Tris-HCl pH= 6.8 (nello staking gel)
2. buffer Tris-HCl pH= 8.8 (nel running gel)
3. buffer Tris-Glicina pH= 8.3 (nei compartimenti anodico e catonico)
lo Staking gel si trova sopra il running gel ed ha pori più grandi per evitare la separazione in base al p.m.
il running gel ha pori più piccoli, ed è qui che avviene la separazione in base alla carica, p.m., forma delle molecole come nella page omogenea.
lo scopo è quello di ottenere bande più strette e x fare qst è necessario che le proteine prima che entrino nel running gel siano già in ordine di mobilità decrescente, e qsto processo si verifica nello staking gel.
per qnto riguarda il funzionamento in dettaglio quello che so é:
la Tris glicina che ha pH= 8.3 è presente sotto forma di ione dipolare per il 95%, per qst quindi la sua carica netta è piccola,e quindi lo ione glicinato ha una mobilità minore dello ione cloruro.
lo ione cloruro invece ha netta - 1, ed è molto più piccolo, per cui ha mobilità maggiore.
ed è per qst che lo ione glicinato resta dietro allo ione cloruro.
quando poi lo ione glicinato entra nello staking gel che ha un pH= 6.8 la sua mobilità si riduce ancora di più. lo ione cloruro invece migra velocemente in testa.
i pH sono scelti in modo tale da avere la mobilità del campione compresa tra quella dello ione cloruro e quella dello ione glicinato.
spero di esserti stata di aiuto |
greace... |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
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Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2008 : 12:04:42
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..."i pH sono scelti in modo tale da avere la mobilità del campione compresa tra quella dello ione cloruro e quella dello ione glicinato", in questo modo ho "inpaccato" la mia proteina e sarà pronta per entrare nel running gel?
Però non riesco a capire ancora una cosa, mi hai scritto che devono entrare in ordine di mobilità crescente, mentre nel mio libro leggo che quando viene applicata la corrente tutte le specie ioniche dovranno migrare alla stessa velocità, altrimenti si verificherebbe un interruzione del circuito elettrico, per cui gli ioni glicinato per migrare alla stessa velocità dei cloruri che hanno mobilità maggiore, si devono trovare in una regione con campo elettrico di intensità maggiore e qui entra in gioco la conduttività e la concentrazione delle specie...
Dunque ma se gli ioni glicinato andranno a uguagliare la velocita dei cloruri come fa la mobilità della proteina-SDS ad essere compresa tra i due? 
grazie per la pazienza! 
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greace
Nuovo Arrivato
Città: ancona
43 Messaggi |
Inserito il - 28 giugno 2008 : 12:44:21
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no allora è nello staking gel che le proteine vengono ordinate in ordine di mobilità DECRESCENTE (e nn crescente cm mi hai scritto tu).
allora..la migrazione degli ioni cloruro produce dietro di sè una zona con minore conducibilità (è come se dietro allo ione si creasse un vuoto di carica).
siccome la conducibilità è inversamente proporzionale all'intensità del campo elettrico, si origina un gradiente di potenziale che fa migrare gil ioni glicinato alla stessa velocità degli ioni cloruro.
il gradiente di potenziale formatosi fa migrare di conseguenza il campione, che viene separato in strette bande a diversa mobilità (bande molto vicine).
quando poi gli ioni Cl-; Campione-; Glicinato-; raggiungono il running gel incontrano un pH più alto (8.8).
gli ioni glicinato vengono completamente deprotonati e la loro mobilità diventa circa uguale a quella degl ioni cloruro (la mobilità degli ioni glicinato cresce perchè manca la specie ionica più mobile).
il gradiente di potenziale viene così a mancare e il campione viene separato in una regiuone a gradiente di potenziale e pH costante come nella page.
nn sò spero di averti chiarito i dubbi |
greace... |
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Ale SS
Nuovo Arrivato
Prov.: Sassari
31 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2008 : 18:54:54
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ok... ho capito finalmente
grazie mille a tutti...disponibili come sempre
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