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bibi22
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5 Messaggi |
 Inserito il - 27 giugno 2008 : 20:43:50
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ciao a tutti! qualcuno sarebbe così gentile da darmi qualche dritta sul tilling? grazie!!!
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bibi22
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 01 luglio 2008 : 19:25:27
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allora c'è qualkuno che può spiegarmi il tilling, please?! ho l'esame la prox settimana!!!  |
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Clivi
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22 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2008 : 13:09:57
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Ciao bibi22, il TILLING (Targeting Local Lesion IN Genomes) è una tecnica che permette di identificare mutazioni (SNP) in Drosophila utilizzando mutanti genetici generati da EMS (etilmetansulfonato) e sfruttando CeI-I, una endonucleasi che taglia i mismatches degli eteroduplex.
Il tilling consiste nell'estrazione del DNA genomico di una collezione di mosche mutagenizzate con EMS con successivo screening di questa libreria mediante NESTED PCR.
Lo screening in particolare prevede 3 reazioni consecutive di NESTED PCR, l'ultima delle quali con un oligonucleotide marcato con 2 fluorofori.
I frammenti di PCR vengono poi denaturati e rinaturati, al fine di formare gli eteroduplex.
I frammenti rinaturati verranno digeriti con CeI-I.
Se il frammento risultante non è tagliato, i fluorofori daranno un segnale dello stesso PM; se invece il frammento è tagliato, essi daranno 2 segnali di diverso PM, la cui somma corrisponde al PM del frammento originario!
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bibi22
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 05 luglio 2008 : 10:09:27
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grazie mille! adesso metto insieme un pò di materiale e spero di chiarirmi le idee!  |
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Cangrande
Utente Junior
Prov.: Verona
280 Messaggi |
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bibi22
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 07 luglio 2008 : 11:58:03
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| sì sì infatti io lo sto studiando nell'ambito del miglioramento delle piante coltivate! cmq credo di essermi fatta un'idea precisa del tilling, vi ringrazio tutti! |
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PaulPetta
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 15 ottobre 2011 : 17:12:17
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Salve, riporto up questa discussione perchè ho qualche problemino con il tilling in Drosophila, e mi sembrava il posto giusto dove chiedere. Stavo guardando appunto il tilling in drosophila su questa review: Nature Reviews Genetics 6, 167-178
http://www.nature.com/nrg/journal/v6/n3/fig_tab/nrg1553_F5.html#figure-title
In arabidopsis: mutagenizzo i semi, le piante derivate sono autoimpollinate. La progenie è utilizzata per preparare i campioni di DNA che vengono riuniti in pool e sottoposti a pcr gene-specifica per individuare poi i singoli mismatch tramite analisi per heteroduplex.
In drosophila invece prendo le mosche e le mutagenizzo, poi le incrocio con femmine con cromosomi bilanciati. Da questo incrocio mi prendo i maschi (F1) e li reincrocio con femmine sempre con cromosomi bilanciati. A questo punto da questo incrocio prendo sia le femmine e i maschi (F2).
E da qui inizio a non capire più cosa viene fatto. Nella review dice che ogni stock è screenato per letalità. Non ho capito perchè. Io credevo che a questo punto mi sarei estratto il DNA e dopo averlo organizzato in pool avrei fatto PCR gene specifica e poi analisi dell'eteroduplex.
aiuuuuuuto  |
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Tazia
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
Inserito il - 08 gennaio 2014 : 10:03:32
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Ciao, riesumo questa conversazione per chiarire un dubbio: perché si forma l'eteroduplex in Arabidopsis? A lezione il mio prof ha detto che si forma perché su un filamento c'è l'O-6 -mG che in aplificazione si appaierà con una T, mentre sull'altro filamento c'è ancora la C che si appaierà con una G e quindi all'annealing si avranno dei mismatch... MA se è vero che ho mutagenizzato dei semi, poi li ho seminati, poi ho autoimpollinato le piante e da quelle piante ho preso i semi per estrarre il DNA e fare la PCR, ormai non dovrebbe essere avvenuta la sostituzione gc --> at? E quindi se non c'è più l'o-6-mg come si forma l'eteroduplex?
Io avrei pensato che potrebbe formarsi per la presenza di più alleli: cioè mettendo in ogni pozzetto il dna estratto da più semi della stessa pianta, e non essendo i semi tutti cloni, magari qualcuno è mutato in quella posizione e qualcuno no... potrebbe essere una spiegazione plausibile? |
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