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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
 Inserito il - 01 luglio 2008 : 17:00:39
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Ciao a tutti!
Ho qualche dubbbio e spero che qualcuno di buon cuore mi aiuti!
Dovrei studiare l'espressione di alcune citochine IL2, IL4, IL6, TNF, INF gamma (se non ricordo male solo queste)nell'uomo; ho pensato di estrarre l'RNA, fare una retrotrascrizione e poi amplificare i geni di interesse. Ma come posso fare a verificare l'espressione di tutti contemporaneamente? o è più conveniente fare amplificazioni separate? e i primers li devo costruire alla CDS o includere anche il resto della sequenza? aiuto...avrei altre mille domande!!!
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Ayla
Utente Junior
Città: Wageningen
573 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2008 : 17:06:20
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| dopo la retrotrascrizione dovresti separare il contenuto in 5 provette ed eseguire la PCR separatamente con primer specifici per ciascun caso. Ti consiglio di inserire anche un controllo positivo tipo rRNA e di fare prove con diverso numero di cicli per regolarti meglio... non devi saturare la tua reazione, altrimenti non ti rendi conto della differenza in espressione. Considera poi che frammenti piú piccoli hanno luminositá minore a paritá di numero di molecole... |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 01 luglio 2008 : 17:18:47
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Grazie Ayla!
non ci avevo pensato...anche se, per poterlo dividere dovrò diluirlo di più, giusto? |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2008 : 00:40:00
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Ma esattamente cosa devi fare?
Certamente devi fare una RT-PCR (retrotrascizione e PCR).
Ma se devi valutare l'espressione devi utilizzare metodi quantitativi o almeno semiquantitativi. La RT-PCR così è solo qualitativa.
Poi sul fatto di valutare l'espressione "contemporaneamente" è un altro discorso, in realtà puoi fare PCR multiplex (anche se è più difficile metterle a punto, e con 5 PCR separate sicuramente è più facile). In ogni caso anche se hai 5 PCR poi puoi seminarle tutte sullo stesso gel e vedi "contemporaneamente" tutte e 5 le tue citochine.
Se fai una Real-Time (quindi PCR quantitativa) il discorso è un po diverso (trovi varie discussioni sul forum), ma ovviamente devi avere la strumentazione!
Insomma dovresti darci alcune indicazioni in più di cosa devi fare esattamente.
Comunque se cerchi sul forum trovi varie discussioni che possono essere interessanti, cerca "quantificazione relativa e assoluta", "semiquantitativa"...
E poi che vuol dire che "diluisci" di più il cDNA, dipende da quanto ne retrotrascivi e che quantità finale hai, basta farne abbastanza per suddividerlo per le varie PCR.
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
 Inserito il - 02 luglio 2008 : 10:07:10
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Ciao GFPina, grazie per i suggerimenti!
Cercherò nel forum ciò di cui potri avere bisogno. Ad ogni modo devo fare una rt PCR semiquantitativa, non una real time. Per "contemporaneamente" intendevo una multiplex, ma come mi suggerisci tu, è sicuramente più difficile (e poi non ho protocolli di rif.): ho già abbastanza problemi nella costruzione dei primers (la %d i match è piuttosto bassa .
Il fatto è che attualmente sto lavorando da sola e quindi non nessuno con cui confrontarmi...
Per fortuna che ci siete voi!!!
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2008 : 19:17:13
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Citazione:
Messaggio inserito da mollichina di pane
.... ho appena letto le discussioni passate che mi ha suggerito GFPina; ho notato che questo link non è più disponibile: http://www.biotecnologie2000.com/Articoli/2003/nov_dic/guida_scelta.html
... che peccato!!! Avevo dubbi anche sulla competitiva per chè alcuni articoli che ho letto mi hanno solo confuso le idee!
Lo so! Infatti se leggevi in fondo alla discussione, ho inserito giusto ieri sera anche questo:
Citazione:
Messaggio inserito da GFPina il - 02 luglio 2008 : 01:03:17 da: http://www.molecularlab.it/forum/topic.asp?TOPIC_ID=2045
Riprendo questa vecchia discussione visto che il link che avevo indicato ormai da tempo non è più disponibile! 
Ma ne ho trovato un altro che mi sembra spieghi le cose in modo abbastanza chiaro, anche se ovviamente facendo pubblicità ai loro prodotti:
RT-PCR: The Basics (Ambion)
Forse ho a casa l'articolo del link non più disponibile (ma non ci giurerei!) se lo trovo te lo mando. In ogni caso se hai dei dubbi scrivi qui e vediamo se riusciamo a risolverli!
In quest'altro link troverai anche dei kit per fare la PCR competitiva, possono essere una buona soluzione nel tuo caso, io prima di avere la Real Time ho utilizzato uno di quei kit!
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 02 luglio 2008 : 23:22:24
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Grazie davvero!
Appena avrò un po' di tempo leggerò cosa c'è sul link ambion e se dovessi avere ancora bisogno, sarò felice di accettare il tuo aiuto!!! |
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rt-PCR
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