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mistyghe
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
 Inserito il - 03 luglio 2008 : 17:43:55
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Salve a tutti, volevo sapere se qualcuno è a conoscenza di cosa sia la Long-(range)PCR e se magari puo' spiegarmi effettivamente perchè conviene usarla.
Grazie mille, ciao:D
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valia
Moderatore
Prov.: UK
1001 Messaggi |
Inserito il - 03 luglio 2008 : 19:22:52
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Ciao mistyghe!
Con long PCR si intende una PCR per amplificare un frammento lungo (maggiore di 3 kb). Di solito a questo scopo si usano Taq particolari, che possiedoo attività di correzione di bozze, così che l'enzima non "scivoli" così spesso e possa arrivare alla fine della sequenza da amplificare. Inoltre bisogna aumentare i tempi di extention: la regione è più lunga, e per amplificarla serva più tempo.
Quando si usa? Quando devi analizzare-clonare un frammento lungo!
Puoi dover clonare un gene particolarmente lungo per studiare gli effetti della sua sovraespressione, o dover verificare che sia avvenuto un riarrangiamento o un'inserzione in un determinato punto del genoma, o ancora potresti dover analizzare la sequenza di un lungo frammento di DNA alla ricerca di mutazioni puntiformi... La lista degli esempi potrebbe continuare all'infinito.
In alcuni casi se la long PCR non dovesse proprio funzionare si possono fare 3-4 PCR che amplificano frammenti parzialmente sovrapposti...
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mistyghe
Nuovo Arrivato
7 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2008 : 12:15:02
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Ti ringrazio, la domanda che mi pongo è come faccio ad individuare il riarrangamento? Cioè con la long ottengo un frammento piu' lungo, ma come faccio a vedere se è riarrangiato o meno?
Grazie, ciao;D |
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E. Coli
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 04 luglio 2008 : 15:18:38
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| per riarrangiato cosa intendi? perchè riarrangiato può essere un vettore plasmidico in cui tu hai inserito clonadolo, un inserto che hai precedentemente ottenuto tramite PCR. quando controlli l'avvenuto clonaggio con una colony PCR e su gel di agarosio osservi bande diverse da quelle attese in alcuni campioni significa che quelli sono riarrangiati. se intendi come puoi capire se il tuo prodotto di long-PCR abbia mutazioni o meno non devi far altro che inviare ad un centro di sequenziamento il tuo frammento con gli opportuni primers. Se hai bisogno contattami e ti dò il sito del centro di sequenziamento al quale io mi riferisco. Ciao! |
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Long-PCR
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