Trattamento con DNase

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Discussione

dabar
Nuovo Arrivato

Prov.: Catania
Citt�: Catania

30 Messaggi

Inserito il - 12 luglio 2008 : 16:59:59

Ciao a tutti,
mi sto apprestando a fare un'esperimento di Real-Time con sonde TaqMan alcune delle quali sn disegnate su singoli esoni, quindi devo trattare con DNasi i miei campioni.
Ho fatto gi� diverse prove di trattamento utilizzando 1 e 2 ug di RNA e trattandolo con DNasi (secondo protocollo Invitrogene) ma ci� che ho notato � che si ha una riduzione variabile dal 25 al 50% della massa totale di RNA.
Avete esperienza a proposito?
I trascritti pi� rari si osservano lo stesso?
Posso ovviare al problema mettendo pi� massa di cDNA per effettuare la Real-Time?
Grazie anticipatamente a tutti coloro che mi risponderanno.
Dabar

Topogigio77
Nuovo Arrivato

Citt�: Milano

37 Messaggi

Inserito il - 15 luglio 2008 : 11:16:22

Ciao,
molto dipende dalla DNase che usi. Quelle classiche prevedono inattivazione col calore, che tanto bene al RNA non fa.
Prove quelle nuove con la Stop Solution (es: Turbo DNase di Ambion). Per i geni poco espressi non serve tanto aumentare il cDNA: considera che anche mettendone il doppio guadagni 1 Ct, con 10 volte tanto guadagni poco pi� di 3 Ct ma entra in gioco il meccanismo dell'inibizione, percui io eviterei. Piuttosto pre-amplificherei il cDNA, � 1 passaggio da 1 ora e non avrai pi� problemi di non vedere geni poco espressi. Se ti interessa il prodotto fammi sapere che te parlo, io lo uso da un annetto. ciao

cin
Utente Junior

Prov.: Padova
Citt�: Padova

558 Messaggi

Inserito il - 15 luglio 2008 : 14:54:40

A me interessa la preamplificazione, puoi metterla qui o nei protocolli? Anch'io uso la Turbo della Ambion.
Grazie

Topogigio77
Nuovo Arrivato

Citt�: Milano

37 Messaggi

Inserito il - 17 luglio 2008 : 12:07:42

ecco qua la pre-amplificazione:

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042472.pdf

http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_042471.pdf

cin
Utente Junior

Prov.: Padova
Citt�: Padova

558 Messaggi

Inserito il - 24 luglio 2008 : 16:13:00

Grazie mille!