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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
 Inserito il - 14 luglio 2008 : 16:25:32
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Ciao a tutti!
Eccomi di nuovo qui a chiedere aiuto...
vorrei sapere se c'è qualcuno che può chiarirmi una cosa: sto disegnando i primers per una rt-pcr (sempre le mie famose citochine) e mi è sorto un dubbio...
...come faccio ad essere sicura che i primers non amplifichino anche del gDNA?
C'è qualche modo per disegnarli con "sicurezza"?
Grazie
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dr zoidberg
Nuovo Arrivato
21 Messaggi |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2008 : 18:11:21
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Grazie davvero per aver risposto così presto!
solo che, se posso dirti una cosa, megablast è meglio usarlo per allineamenti lunghi.
Per sequenze corte come i primers è meglio settare i parametri.
Stavo appunto cercando di ricordare il link su blast per le short sequences...
ma non me lo ricordo...se lo sai puoi dirmelo, per favore?
Grazie
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2008 : 19:03:06
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Grazie chick80!
Credo di sì  (non ne sono sicura perchè è davvero parecchio tempo che non lo uso).
L'unica cosa...leggendo velocemente...ad un certo punto dice di concatenare i primers inserendo una stringa di 20 o più nucleotidi.  Che significa?...o meglio quali devo inserire?
Scusami se approfitto di te, ma come dicevo in un messaggio precedente, sono sola in lab.  e non so con chi confrontarmi!
Ciao. |
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2008 : 19:43:10
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In pratica ti suggerisce di scrivere la sequenza del primer 1, poi 20 o più N (= base qualsiasi) e poi il primer 2.
Siccome BLAST fa allineamenti locali ti dovrebbe trovare comunque la sequenza.
Non ho mai provato a fare questa cosa però, quindi non so aiutarti di più.
Sposto il messaggio nella sezione bioinformatica, magari qualcun altro sa dare una risposta più esauriente
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 14 luglio 2008 : 21:27:14
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Ok...grazie!
anch'io non ho mai provato a concatenarli...nel frattempo ci provo, così vedo cosa ne viene fuori.
Ciao!!! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2008 : 01:35:19
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Ma a me sembrava di ricordare che anche se fai il blast normale (BLASTN) inserendo una sequenza corta come quella dei primers, ti cambia automaticamente i parametri!!!  Infatti viene fuori questa scritta: "Your search parameters were adjusted to search for a short input sequence."
Io non ho mai cambiato niente! Ma lascio dire agli esperti informatici! 
Comunque, ovviamente è consigliabile sempre fare un blast, ma per essere sicura che i primers funzionino solo su cDNA basta che ne disegni almeno uno a cavallo di due esoni!!!
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mollichina di pane
Utente Junior
121 Messaggi |
Inserito il - 15 luglio 2008 : 09:58:26
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Giusto!Sei illuminante come sempre GFPina!
Per il blast forse hai ragione tu...ricordavo diversamente, ma credo che ora aggiusti direttamente i paramentri per short sequences.
Grazie ancora. |
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