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crieilyx
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
 Inserito il - 18 luglio 2008 : 16:07:53
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avremmo bisogno di un chiarimento sull'immunoprecipitazione. Nelle nostre lastre vediamo sempre una banda a circa 20kDa.. è possibile che sia la catena leggera dell'anticorpo usato per immunoprecipitare? se sì.. come possiamo non vederla?
grazie
cri&ilyx
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paolo865
Utente Junior
Prov.: Como
Città: Olgiate Comasco
262 Messaggi |
Inserito il - 18 luglio 2008 : 16:13:14
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| si è quella.fai correre di più il gel così la fai uscire nel running buffer..almeno che la tua proteina d'interesse pesi 20 kDa |
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crieilyx
Nuovo Arrivato
2 Messaggi |
Inserito il - 18 luglio 2008 : 16:54:55
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ciao paolo865!
grazie per la risposta tempestiva!
altra domanda.. (rivolta a tutti!) come possiamo normalizzare le bande dell'immunoprecipitazione? è attendibile farlo con le bande delle IgG? poi.. se qualcuno ha una documentazione + che attendibile sull'immunoprecipitazione (in particolare sulle igG) può mandarcela?!
grazie mille
cri&ilyx |
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2008 : 19:05:00
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per normalizzare hai bisogno di fare un dosaggio proteico prima di mettere l'anticorpo per immunoprecipitare e poi normalizzare i tuoi compioni in funzione del campione con il dosaggio più basso (non so se mi sono spiegata  )Fatto questo, non puoi normalizzare con la banda delle IgG, dal momento che quello è l'anticorpo che metti tu, quindi, a meno di errori di pipettaggio, ne metti sempre la stessa quantità in tutti i campioni e quindi alla fine avrai una banda costante tra le varie lane. |
...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 11:50:03
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secondo me l'idea non era male..perchè io per normalizzare rilevo sulle mie membrane una proteina che so che non varia la sua espressione nelle mie 3 linee cellulari..
in questo caso penso che cmq tu non possa farlo perchè l'intensità delle bande delle IgG dipenderà da quanta proteina di tuo interesse hai nel campione..più proteina = più anticorpo legato = meno banda IgG..non so se mi sono spiegato..
cmq sul fatto del dosaggio penso che tu lo faccia prima di immunoprecipitare, in modo da caricare poi lo stesso quantitativo di proteine in tutti i tuoi campioni.. |
Fai attenzione quando leggi libri di medicina..potresti morire per un
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Iside
Utente Attivo
Città: Napoli
1375 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 11:57:54
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Citazione:
Messaggio inserito da nyo84
in questo caso penso che cmq tu non possa farlo perchè l'intensità delle bande delle IgG dipenderà da quanta proteina di tuo interesse hai nel campione..più proteina = più anticorpo legato = meno banda IgG..non so se mi sono spiegato..
no aspetta nyo, non mi trovo...
allora, se fai un dosaggio prima di mettere l'ab per immunoprecipitare, puoi normalizzare i tuoi campioni in funzione delle proteine totali e non della tua proteina di interesse! l'ab lo metti in funzione delle tue proteine totali, quindi, se hai normalizzato, ne metterai sempre la stessa quantità, indipendentemente dalla concentrazione della tua proteina di interesse, ti trovi con me? Poi, l'intensità delle bande IgG sarà sempre la stessa, perchè nella reazione tu immunoprecipiti le IgG (sia quelle legate alla tua proteina che quelle libere), infine, quando corrri i campioni in sds-page, rompi il complesso e quindi le IgG devono essere per forza costanti. |
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 13:55:36
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mmm..stiamo dicendo o intendendo 2 cose diverse forse..o forse sono solo io che non capisco..
quando faccio dei WB, io faccio una dosaggio prima, in modo da caricare lo stesso quantitativo di prot in ogni pozzetto,poi rilevo la mia prot d'interesse. però mi è stato insegnato che,per ridurre ulteriormente eventuali errori durante l'esperimento,devo normalizzare i miei risultati guardando l'espressione di una proteina che so che viene espressa allo stesso modo in tutti i miei campioni..in letterattura usano spesso l'actina ad es...
per quel che riguarda l'IP ho capito cosa intendi..in quel caso allora,facendo un dosaggio prima dell'esperimento, "cri&ilyx" potrebbe normalizzare i suoi risultati con le bande delle IgG.. |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 14:22:24
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Esatto iside, credo il ragionamento di nyo84 possa funzionare
solo in un gel nativo (in cui il complesso Ag-Ab non è rotto).
Immagino che qui invece si parli di SDS-PAGE. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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nyo84
Utente Junior
Prov.: Brescia
Città: Piancogno
239 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 14:51:57
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ok..ho capito.. |
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manuela.piazzi
Nuovo Arrivato
Prov.: Bologna
8 Messaggi |
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immunoprecipitazione
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