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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
 Inserito il - 18 luglio 2008 : 20:00:57
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Salve
Sto avendo problemi con un clonaggio e volevo sapere se sono io che non vado o e' il vettore che e' fuso,praticamente sto usando come da titolo un pGEM T easy vector della promega e le colonie sono sempre negative.
Oggi ho pensato che probabilmente si era richiuso e che pertanto non mi faceva mettere l inserto!! cosi' ho preso un'aliquota del vettore e ho fatto una PCR e la cosa che mi ha sorpreso era che il vettore mi dava una banda e anche bella intensa,cioe', se fosse stato linearizzato non sarebbe dovuto uscire niente!!
quello che volevo chiedervi e' se ,in questi kit e'normale che ci siano dei vettori chiusi ?
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E. Coli
Nuovo Arrivato
22 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2008 : 22:19:46
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io ho dovuto clonare in pGEM T easy, ma di easy non ha proprio nulla...tanto che mi sono dovuta arrendere per questioni di tempo e aggiustarmi con clonaggi in TOPO TA della Invitrogen!
Anch'io avevo sempre trasformazioni negative! ...e se avevo colonie il controllo per colony era sempre negativo nonostante il protocollo di colony pcr fosse ottimizzato al 100%.
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 19 luglio 2008 : 23:59:29
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Ma teoricamente le due T terminali non dovrebbero impedire la ricircolarizzazione?? 
direi che c'è qualcosa che non va, pat...
Io l'ho usato una volta per clonare un frammento di PCR (Taq) e ha fatto il suo sporco lavoro .
Se il vettore si è richiuso davvero, allora non può nemmeno più aprirsi, visto che il sito di
clonaggio multiplo non è "ricombinante" in senso stretto, cioè non ha un sito di restrizione
(lo dice il manuale). In pratica sei fregato, una volta chiuso è inutilizzabile!
Ma fammi capire: tu hai testato con due primers T7 e SP6, attorno al polylinker?
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Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 11:24:26
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Si Dionysos,ho fatto una PCR con quei primers,
che si sia richiuso puo' essere dovuto al fatto che abbia perso le T quindi non ci sono piu' estremita' OH - OH e puo' circolarizzare...,pero' sul kit non dice come ad esempio in altri che l efficenza e' tipo 90%,quindi appunto mi chiedevo se fosse normale,comunque sia il fatto che anche voi avete avuto i vostri pessimi risultati pero' mi rincuora |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 20 luglio 2008 : 13:36:50
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Guarda, stando al troubleshooting questa cosa delle T dovrebbe accadere "utilizzando DNA
ligasi potenzialmente contaminate da esonucleasi" cioè sostanzialmente ti dicono di usare
quella allegata al pGEM, guarda che caso. Comunque tu prova per sicurezza ad usare una
aliquota fresca di vettore e magari ad usare una ligasi nuova , appena aperta, giusto
per escludere quest'ipotesi. Il troubleshooting cmq conferma che se il vettore ti
si è richiuso tutto, allora sei nel guano fino al collo  perchè non può più
essere aperto nello stesso sito! |
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GFPina
Moderatore
Città: Milano
8408 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 00:50:24
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
... Il troubleshooting cmq conferma che se il vettore ti si è richiuso tutto, allora sei nel guano fino al collo perchè non può più essere aperto nello stesso sito!
 mmm bello sto vettore!!!
Patrizio passa al TOPO cloning!!! |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 02:49:33
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maddai, non prendetevela tutti col povero pGEM!!
lui di per sè non è male...solo che il rischio di prendersi una bidonata è alto |
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giov.linux
Nuovo Arrivato
Prov.: Bolzano
Città: napoli
14 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 10:58:57
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strano io ho clonato diversi geni in pgem, esperimenti riusciti al primo colpo o facevo pcr su cDNA purificavo il frammento amplificato da gel con kit e poi clonavo in pGEM, veramente easy quale il tuo DNA di partenza? che protocollo usi? ma che polimerasi usi? la pfu? ancora come fai lo screening? la beta-gal? nel caso io non mi fiderei, "piccherei" almeno 4 colonie e le saggerei per PCR
Senza queste informazioni non possiamo sapere se è avvenuta una fantomatica circolarizzazione oppure un più probabile "pasticcizione" da parte tua.
Buona fortuna |
giov.linux
Biologo Molecolare |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 12:18:20
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Beh già il fatto che la PCR sul templato gli abbia fornito
un risultato come quello che dice, è già di per sé allarmante . . . |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 21 luglio 2008 : 16:29:01
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Citazione:
Messaggio inserito da giov.linux
strano io ho clonato diversi geni in pgem, esperimenti riusciti al primo colpo o facevo pcr su cDNA purificavo il frammento amplificato da gel con kit e poi clonavo in pGEM, veramente easy quale il tuo DNA di partenza? che protocollo usi? ma che polimerasi usi? la pfu? ancora come fai lo screening? la beta-gal? nel caso io non mi fiderei, "piccherei" almeno 4 colonie e le saggerei per PCR
Senza queste informazioni non possiamo sapere se è avvenuta una fantomatica circolarizzazione oppure un più probabile "pasticcizione" da parte tua.
Buona fortuna
Il mio frammento e' stato amplificato su cDNA (c'e' da dire che sono stati fatti molti clonaggi e che precedentemente venivano ),la Taq e' quella della eppendorf,si, utilizzo beta gal ( le uniche colonie erano quelle blu ),cmq provero' con lo stesso vettore che mi faro' prestare,e vediamo se e' il mio che non va,a...il protocollo che uso e' quello che consigliano loro |
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pGEM T easy Vector chiusi
Didattica
