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alebe
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2006 : 16:06:29
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ciao a tutti sono alessia, ho iniziato circa un mese fa ad utilizzare la real time per la detection di OGM in mangimi, ho ordinato primer e probe già disegnate e ho messo a punto la simplex, so che è possibile effettuare delle multiplex, ma non riesco a trovare un protocollo che spieghi nei dettagli la metodica.
Sicuramente qualcuno di voi è in grado di aiutarmi....CI CONTO!!!
Grazie mille
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chick80
Moderatore
Città: Edinburgh
11491 Messaggi |
 Inserito il - 04 gennaio 2006 : 22:14:02
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Beh, se sai fare la simplex sai fare anche la multiplex! E' molto semplice: nella tua miscela di reazione insieme a primers e sonda per il gene che guardi con la simplex metti anche primers e sonda dell'altro gene (suppongo tu voglia mettere 18S o simili).
Accorgimenti:
1) ovviamente la multiplex si fa solo con sonde Taqman, niente multiplex con il SYBR Green
2) le due sonde devono avere fluorofori diversi
3) prima di fare i tuoi esperimenti devi "calibrare" un po' l'esperimento. Prendi dei controlli positivi e prova varie diluizioni di primers e sonda dei 2 geni prima singolarmente (questo probabilmente l'hai gia' fatto) e poi insieme, per assicurarti che non interferiscano tra di loro.
4) Usando uno standard nella multiplex potresti anche evitare la curva di taratura, ma se vuoi una cosa fatta bene falla cmq.
5) Consiglio di non cercare piu di 3 geni contemporaneamente, perche' poi diventa molto complesso e hai molta interferenza. Personalmente ho fatto solo simplex e duplex ma pare che anche con 3 non ci siano molti problemi. |
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alebe
Nuovo Arrivato
5 Messaggi |
Inserito il - 05 gennaio 2006 : 12:27:56
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Grazie mille sei stato gentilissimo, farò un po di prove per mettere a punto il protocollo!!!
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