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pinky3
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2008 : 12:19:10
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Salve a tutti,
sono nuova del forum e così colgo l'occasione per salutare tutti e fare i complimenti per questo bel forum...beh, veniamo al mio quesito...
mi accingo a sostenere l'esame di microbiologia ed immunologia e volevo sapere delle cose a proposito dell'immunofluorescenza:
1- come si fa l'immunofluorescenza per antigeni che si trovano all'interno della cellula? devo rendere permeabile la cellula e poi la tecnica è identica a quella per antigeni extracellulari? (è solo per capire il funzionamento generale, non è che mi serve il protocollo preciso)
2- qual è il limite dell'immunofluorescenza diretta? quando è meglio usare quella indiretta e perchè?
Grazie a tutti!!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 15:41:22
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1 - Sì, di solito si fanno trattamenti con PBS+saponina prima di effettuare la marcatura interna
2 - Quella diretta è meno sensibile, perchè senza il metodo degli anticorpi successivi
(cioè primario prima e secondario poi) avrai solo una unità luminosa per ogni antigene catturato,
diversamente potresti ottenere un'amplificazione del segnale (1 antigene --> 1 Ab primario -->
più Ab secondari fluoromarcati in grado di legarsi al primario, quindi più unità luminose). |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 15:50:36
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Per quanto riguarda il punto 2 concordo con Dionysos e aggiungo solo qualche chiacchiera in più: l'Ab primario si lega direttamente all'epitopo che tu cerchi ed è ad esempio un anticorpo di origine murina; come diceva Dionysos 1 epitopo=1anticorpo=1segnale fluorescente.
Con la marcatura indiretta è invece l'Ab secondario ad essere marcato. Questo potrebbe essere prodotto in coniglio contro la porzione costante degli anticorpi di topo (che era il tuo anticorpo primario); poichè l'Ab secondario riconosce più porzioni dell'Ab primario, avrai che più Ab secondari (quindi marcati) si legano ad 1 Ab primario. In questo modo il segnale è amplificato.
Spero di esserti stata utile |
Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 16:45:42
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| Esatto, perchè il secondario è una miscela policlonale. |
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pinky3
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 16:54:42
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oh Grazie mille....
giusto due precisazioni:
1-scusate l'ignoranza ma per cosa sta PBS? possiamo dire in linea generale che la permealizzazione si ottiene con un detergente?
2- ok, quindi + anticorpi secondari si legano a quello primario,giusto?
quindi non è un solo anticorpo che si lega alla porzione Fc di un altro, ma si legano + anticorpi a livelli diversi? se ho capito bene quindi con la tecnica diretta potrei rischiare di avere una fluorescenza troppo "debole" per essere vista, giusto?
grazie ancora!!!! |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 17:29:34
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il PBS è una soluzione salina fisiologica con cui lavori quando lavori con colture cellulari...per fare lavaggi ecc perchè è isotonica e non tossica per le cellul..deduco che tu sia di medicina si la permeabilizzazione in linea di massima si ottiene con un detergente come saponina, Tween 20 o Triton ma ci sono metodi che prevedono l'uso di solventi organici come metanolo o acetone..si va un po' a naso perchè dipende dall'antigene che si va a marcare e dall'anticorpo che si ha.. e poi sì con la marcatura indiretta hai una maggior possibilità di rilevare il segnale appunto perchè un anticorpo secondario può riconoscere un pezzo del primario, un secondo Ab un altro, un terzo un altro ancora e in tal modo il segnale di fluorescenza viene amplificato. |
Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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immunofluorescenza intracellulare
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