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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2008 : 21:16:29
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raga mi sto scervellando ma non riesco a capire come si possa costruire un primer per il metodo di sequenziamento di sanger:
visto che il metodo di sequenziamento serve per determinare la sequenza sconosciuta, come facciamo a costruirgli un primer?
vi ringrazio in anticipo!
P.s. ho l'esame di biologia molecolare 1 martedì mattina, spero che qualcuno mi aiuti grazie!!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2008 : 21:35:56
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| metti il frammmento in un vettore ...e poi ci costruisci i primers sul vettore |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
 Inserito il - 07 settembre 2008 : 22:42:52
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A dir poco, geniale!!!! |
 
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 23:08:36
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Citazione:
Messaggio inserito da Schuldiner86
A dir poco, geniale!!!!
lo penso anch io ...e ogni volta che lo faccio e' come se fossa la prima volta
anche se la tua mi sembrava ..come si dice da noi una frase un po' paraculo...che tradotto vuol dire presa in giro |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 07 settembre 2008 : 23:15:50
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| No che presa in giro? Ci sono rimasto male perché ho visto il post, ho iniziato a pensarci e la prima cosa che mi è venuta in mente è stata...Ma come ho fatto a essere così stupido e a non pensarci tutte le volte che ho studiato il sequenziamento di Sanger? Ma adesso mi viene da chiedere, come faccio a conoscere le estremità del frammento da sequenziare per clonarlo? Si fa un clonaggio con blunt ends? |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 00:12:09
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
metti il frammmento in un vettore ...e poi ci costruisci i primers sul vettore
cioè si mette il frammento in un vettore e utilizzi come primer l'rna che viene trascritto dall'ospite?
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 08:07:28
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Citazione:
Messaggio inserito da Schuldiner86
, come faccio a conoscere le estremità del frammento da sequenziare per clonarlo? Si fa un clonaggio con blunt ends?
I'm sorry avevo inteso male
Cmq si, potresti utilizzare vettori che hanno estremita' blunt,anche se corri il rischio che si richiuda su se stesso,ma si potrebbe usare anche un vettore con estremita' protrudent dove la parte complemetare sara' polemerizzata dalla polimerasi( ma credo che nessuno mai l abbia fatto per un sequenziamento visto che si prolungherebbe il lavoro...perche'dovrebbe essere una procedura che precede il sequenziamento ) ....sicuramente in questo caso l efficenza e' bassissima
Oppure sembra che possa essere utile se il frammento e il vettore hanno estremita' coesive diverse fare un operazione di filling-in se sporgenti in 5' o trimming se sporgenti in 3' ....questo fatto non lo sapevo l ho visto ora
Kondalord,noo ma che RNA ,per ciascun vettore di clonaggio che usi conosci la mappa ti fai i primers sul vettore adiacente al frammento inserito |
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Schuldiner86
Utente Junior
Prov.: Viterbo
Città: Bologna
581 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 09:05:46
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| Lo so che magari è una bestemmia, ma sarebbe possibile trasformare le blunt ends in sticky usando la terminal transferasi, anche se l'enzima è efficiente su dsDNA solo in presenza di Co2+? Si fannno aggiungere magari code di C sul frammento da sequenziare e code di G sul plasmide, cosicché i legami idrogeno che si formano prima dellla ligation sono anche più stabili? |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 09:57:57
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[/quote]
Kondalord,noo ma che RNA ,per ciascun vettore di clonaggio che usi conosci la mappa ti fai i primers sul vettore adiacente al frammento inserito
[/quote]
aa ho capito! usando ad esempio m13 che produce fagi con dna a singolo filamento, si rimuove la parte proteica da m13 e si utilizza il suo genoma con integrato il mio frammmento(integrato in un sito di restrizione noto) costruendo un primer in base al sito adiacente al frammento. Poi si può utilizzare il tutto per sequenziare con sanger giusto? |
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babilei
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 10:32:18
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non è che la domanda fosse "quali sono i criteri per costruire un primer per sequenziamento?"
mi sembra strano che ti ritrovi con un frammento di DNA "vagante". 
o è una pcr o è un frammento in un clone, comuqneu qualcosa che dovresti già sapere cos'è.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 10:39:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Schuldiner86
Lo so che magari è una bestemmia, ma sarebbe possibile trasformare le blunt ends in sticky usando la terminal transferasi, anche se l'enzima è efficiente su dsDNA solo in presenza di Co2+? Si fannno aggiungere magari code di C sul frammento da sequenziare e code di G sul plasmide, cosicché i legami idrogeno che si formano prima dellla ligation sono anche più stabili?
Diciamo che su queste cose da quanto ho capito puoi divertirti un po' come ti pare,ovviamente in teoria tutto e' facile a dirsi ma dalla mia esperienza mi accorgo che tra dire e il fare ci sono di mezzo molti oceani...cmq sempre in teoria potresti come dici tu con la terminal tranferasi aggiungere le C su un plasmide con estremita' blunt e poi le G sul frammento,oppure potresti linearizzare il plasmide con un enzima di restrizione e poi aggiungere le C e le G sul frammento ...li fai appaiare e con una polimerasi riformi i siti di restrizione di quell enzima |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 10:45:35
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Citazione:
Messaggio inserito da babilei
non è che la domanda fosse "quali sono i criteri per costruire un primer per sequenziamento?"
mi sembra strano che ti ritrovi con un frammento di DNA "vagante".
o è una pcr o è un frammento in un clone, comuqneu qualcosa che dovresti già sapere cos'è.
non so se hai letto, ma ho detto che domattina ho l'esame di biologia molecolare 1, quindi non ho nessun frammento in mano, è solo una domanda per capire come è possibile fare il sequenziamento di sanger, visto che sul libro non è molto esaustivo e le slide dalle slide della prof non si capisce molto.
Cmq ho capito adesso che vuol dire inserire il frammento in un vettore e usarlo per il sequenziamento (anche s eè un argomento di biologia molecolare 2 )
grazie tutti x le risposte e sopratutto a patrizio
ciao |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 10:55:00
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Citazione:
Messaggio inserito da kondalord
aa ho capito! usando ad esempio m13 che produce fagi con dna a singolo filamento, si rimuove la parte proteica da m13 e si utilizza il suo genoma con integrato il mio frammmento(integrato in un sito di restrizione noto) costruendo un primer in base al sito adiacente al frammento. Poi si può utilizzare il tutto per sequenziare con sanger giusto?
si esatto...ma tanto M13 per per il sequenziamento di sanger non credo che si usi piu,visto che c'e' la PCR che fa tutto lei in tempi piu' rapidi,cmq sanger credo che utilizzo' M13
Tra l altro il metodo dei dideossi e' superato dal pirosequenzing
e dopo?? dove si arrivera'...mha..staremo a vedere
OT:kondalord con chi fai l esame di biol molecolare con la Gadaleta? |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 11:00:57
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Citazione:
Messaggio inserito da babilei
non è che la domanda fosse "quali sono i criteri per costruire un primer per sequenziamento?"
be non credo altrimenti avrebbe chiesto...quali sono i criteri per costruire un primer? ...indipendentemente dal fatto che sia per il sequenziamento o meno
Citazione:
Messaggio inserito da babilei
mi sembra strano che ti ritrovi con un frammento di DNA "vagante".
o è una pcr o è un frammento in un clone, comuqneu qualcosa che dovresti già sapere cos'è.
si,vaglielo a dire a quelli che hanno sequenziato il genoma umano se sapevano cos erano quei pochi frammenti
ma di esempi piu' semplici ce ne sono.... |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 11:18:16
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
Citazione:
Messaggio inserito da kondalord
aa ho capito! usando ad esempio m13 che produce fagi con dna a singolo filamento, si rimuove la parte proteica da m13 e si utilizza il suo genoma con integrato il mio frammmento(integrato in un sito di restrizione noto) costruendo un primer in base al sito adiacente al frammento. Poi si può utilizzare il tutto per sequenziare con sanger giusto?
si esatto...ma tanto M13 per per il sequenziamento di sanger non credo che si usi piu,visto che c'e' la PCR che fa tutto lei in tempi piu' rapidi,cmq sanger credo che utilizzo' M13
Tra l altro il metodo dei dideossi e' superato dal pirosequenzing
e dopo?? dove si arrivera'...mha..staremo a vedere
OT:kondalord con chi fai l esame di biol molecolare con la Gadaleta?
OT: si con la gadaleta domani vi faccio sapere come è andato ciaoo |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 11:21:20
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| ,un consiglio che ti do...piu' o meno come con tutti i prof,si sicuro e deciso nelle risposte |
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babilei
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 16:22:55
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si,vaglielo a dire a quelli che hanno sequenziato il genoma umano se sapevano cos erano quei pochi frammenti
[/quote]
infatti erano frammenti shotgun del genoma o di bac fatti dal genoma clonati in vettori che conoscevano.
[/quote]
ma di esempi piu' semplici ce ne sono....
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 17:14:15
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babilei
il tema era: come costruire dei primers per il sequenziamento per un frammento di cui non si conosce la sequenza
ho detto che dei vettori usati non si conosce la sequenza?
e' normale che non ti vendono vettori alla cieca
Ritornando a noi...nel progetto genoma umano..e non solo...siamo di fronte a frammenti di cui non si conosce la sequenza? rientra nel mio caso?
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babilei
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 18:35:23
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diciamo che non mi sono spiegata bene
io intendo che se tu in laboratorio stai facendo un esperimento, manipoli frammenti di DNA che sai da dove vengono e dove vuoi fare finire. E fare un primer per sequenziarli è il tuo problema minore, perchè se decici di clonarli, il primer lo fai sul vettore, mentre se hai fatto una pcr il primer lo hai già costruito (più o meno).
Difficile che passeggiando trovi un frammento di DNA e decidi di sequenziarlo.
I frammenti shotgun rientrano in questo caso, sono frammenti causali, che quindi non conosci ma che cloni, ne conosci la storia e quindi sai esattamente che primer usare per sequenziarli; in questo senso non sono frammenti vaganti, di cui non sai nulla.
Infine i criteri per costruire i primer di PCR e quelli di sequenziamento sono lievemente diversi perchè devi tenere conto del fatto che quando sequenzi perdi generalmente le primer 30-50 basi, parametro che nella progettazione di primer da pcr non ha nessun ruolo.
Diciamo anche allora che il tema era poco chiaro??
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 08 settembre 2008 : 18:48:38
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Citazione:
Messaggio inserito da babilei
diciamo che non mi sono spiegata bene
Diciamo anche allora che il tema era poco chiaro??
l importante che tutto e' chiaro per tutti |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 13:11:27
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weeeeee ho preso 27!!!!
e indovinate un po, mi è capitata la domanda sul sequenziamento
grazie a tutti!! |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 13:44:33
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| complimenti ...io presi trenta |
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kondalord
Nuovo Arrivato
Prov.: Bari
Città: altamura
68 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 14:10:40
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Citazione:
Messaggio inserito da Patrizio
complimenti ...io presi trenta
diciamo che io vado di fretta...  sto puntando a fare + esami possibili nel + breve tempo possibile
questo lo preparato il mese di agosto tra vacanze e mare avrò studiato si e no 20 giorni , anzi mi sono meravigliato di aver preso 27...
cmq grazie sei stato illuminante
alla proxima ciaoo |
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aiuto urgente sui Primer nei sequenziamenti
Didattica
