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manuela83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
 Inserito il - 09 settembre 2008 : 11:39:56
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ciao a tutti!!! sto cercando di effettuare un clonaggio in un vettore pNEB193!!! il plasmide è lungo 2673bp e il mio inserto è di 2448!!!
dopo lunghi tentativi e utilizzando un rapporto plasmide/inserto di 1:5 sono riuscita ad ottenere dei cloni positivi!!!! ora però arriva il mio grosso problema: devo sequenziare l'inserto per verificare che si sia inserito correttamente e sia completamente wt ma non riesco ad amplificarlo.riesco solo a vedere l'inizio e la fine!!!! c'è qualcuno che può dirmi come ovviare a questo problema??? ho provato anche a tagliarlo in punti diversi con diversi enzimi di restrizione pensando che magari si fossero formate strutture secondarie....ma non è cambiato nulla!!!! non so più che fare!!!!!qualcuno mi aiuti!!!grazie
manu
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 11:57:06
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Ciao!
Allora, sparo un pò di cavolate perchè mi piacciono le PCR  , mi perdoneranno gli esperti del forum se scrivo eresie o cose non applicabili  e mi perdonerai tu se scrivo cose per te banali a cui hai già pensato 
Premetto che non sono molto pratica, ma mi sembra che l'inserto sia decisamente molto grande rispetto al vettore!
Se fosse solo per verificare la corretta inserzione del tuo pezzetto, potresti amplificare la regione "di attacco" a monte e a valle: se c'è amplificazione e la sequenza è giusta l'inserto si è clonato bene.
Penso che vedi solo l'inizio e la fine perchè l'inserto è molto grande.
Ora ti chiedo una cosa probabilmente scontata, ma siccome hai scritto che tagliando con enzimi di restrizione "non è cambiato nulla" nel risultato..Hem, scusa non mi odiare: hai cambiato i primers?
Comunque durante la mia attività di tesi triennale, dovevo amplificare un inserto grandino (1500 bp) e non ho usato la Taq normale, ma il kit per PCR Expand High Fidelity (Roche) che contiene un mix di due polimerasi (TaqDNA e PwoDNA) in grado di produrre trascritti con alta specificità e con un basso numero di errori...
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Nasce, cresce e poi finisce. Per quanto triste è la legge universale.
Ciò che è stato nn tornerà. Il massimo che puoi fare è sperare che quello che sarà, sia meglio.
Nessun rimorso nè rimpianto, è inutile.
Carpe diem: panta rei |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 12:16:31
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Citazione:
il plasmide è lungo 2673bp e il mio inserto è di 2448!!!
EHH!?!  Sei sicuro di non aver scritto male le dimensioni dell'inserto??
Mi sembra decisamente ai limiti del possibile!
Citazione:
riesco solo a vedere l'inizio e la fine!!!!
Intendi dire che l'elettroferogramma di sequenziamento si interrompe?
Dovresti controllare :
- in che modo finisce il segnale (crolla di netto, diventa irregolare, ecc.)
- dopo quante bp
In base a questo puoi capire se è colpa di una struttura secondaria,
oppure, come suggerisce rosy85, dell'inserto che è troppo grande.
Citazione:
ho provato anche a tagliarlo in punti diversi con diversi enzimi di restrizione pensando che magari si fossero formate strutture secondarie....ma non è cambiato nulla!!!!
Domanda forse inutile ma necessaria: dopo aver linearizzato con gli enzimi, hai usato
almeno un primer "interno", giusto? (cioè, interno rispetto al sito di taglio).
Citazione:
produrre trascritti con alta specificità e con un basso numero di errori...
Uh ?!?! "trascritti"?? |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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manuela83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 12:33:20
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Purtroppo le dimensioni dell'inserto non sono sbagliate!!!! sono proprio 2448bp!!!! riesco solo a vedere l'inizio e la fine perchè in pcr riesco solo ad amplificare con la coppia di primers che utilizzo per le prime 300 bp e quelle per le ultime 300 bp circa!!!
si, ovvio che quando ho tagliato ho poi utilizzato dei primers interni!!!
I primers sono gli stessi che utilizzavo per amplificare l'inserto a partire da cDNA e quindi sono sicura che funzionano!!!! |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 12:42:54
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Citazione:
produrre trascritti con alta specificità e con un basso numero di errori...
Uh ?!?! "trascritti"??
amplificati perdono |
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Rosy85
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 12:48:39
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| Dividi l'inserto a metà: clona le prime 1224 basi in un vettore e successivamente altre 1224 in un esperimento diverso. E' un'idiozia? |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 12:52:36
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Cioè, io sono un po' lento a capire... tu hai usato:
-------> .............(2448 bp).................primer 2
primer 1 ...........................................<-------
Per amplificare tutto l'inserto
e questi sai già che funzionano.
Poi hai amplificato solo l'inizio e solo la fine, usando:
------> ....(300 bp iniziali)......primer 3.....(porzione centrale).....------>...... (300 bp finali)... primer 2
primer1 ............................. <------....................................primer4.............................<-------
Giusto? Ho capito bene?
Correggimi se sbaglio. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 13:52:41
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Citazione:
Messaggio inserito da manuela83
ora però arriva il mio grosso problema: devo sequenziare l'inserto per verificare che si sia inserito correttamente e sia completamente wt ma non riesco ad amplificarlo.riesco solo a vedere l'inizio e la fine!!!!
Ciao! anch io sono alle prese con un frammento di 2,3 kb...che dovro' clonare in un vettore di 3 kb circa 
Cmq anche a me non e' chiaro qualcosa...amplificarlo o sequenziarlo?
perche' nel primo caso...se hai un sequenziatore come quello usato da noi massimo arrivi a 500 basi per reazione
poi per vedere l ordine non per forza devi sequenziarlo,vedi la mappa del tuo vettore e stacca il frammento con gli enzimi,scegli quelli che ovviamente tagliano anche all interno del frammento fai 2 conti e risali alla posizione ....un po' come la mappa di restrizone
se il problema e' amplificarlo...mi ricollego alla domanda di Dyonisos |
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manuela83
Nuovo Arrivato
3 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 15:42:17
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si Dionysos ho fatto come dici tu utilizzando in totale 7 coppie di primes e quindi suddividendo l'inserto in 7 amplificati!!!
io ho la necessità di sequenziare per verificare che sia completamente WT!!!
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 22:25:57
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| ma scusa..non te l hanno detto quant'e' il massimo della sequenza che ti fa il sequenziatore? non puoi farlo a meno che non tagli il frammento e ti metti a riclonare e overlappare...altrimenti ordina piu' primers e li usi come interni e ti sposti con i primers nella reazione di sequenziameno |
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 09 settembre 2008 : 23:48:06
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Già...mi sa che devi fare una specie di walking....
Meglio se ti rivolgi ad un centro. |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 11:19:37
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per sapere se hai clonato nel verso giusto usa i mprimers sul vettore, M13 o T7 a seconda del vettore.
E si per sequenziarlo tutto devi usare dei primers interni.
Piuttosto che sequenziare amplificati ti consiglio di sequenziare il plasmide con l'inserto utilizzando i primers interni.
Sei sicura di aver inserito il frammento giuso? come mai non si amplificano frammenti interni?
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Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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babilei
Nuovo Arrivato
10 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 18:49:16
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Anyra dice la cosa più giusta.
Hai il plasmide... sequenzia quello.
Una sequenza con primer sul vettore, che quindi ti permetta di leggere una parte di vettore e una di inserto, ti dice subito se è correttamente inserito.
Se poi vuoi l'intera sequenza dell'inserto fai il primer walking.
Non fare su PCR perchè potresti introdurre degli errori che non ci sono sul plasmide, a meno che non usi una taq proofreading.
Ma poi che senso ha se hai il plasmide già pronto
Con 4 sequenze fatte su un 3130xl o 3730xl, che fanno fino a 1000 basi, te la dovresti cavare. Due partendo da un lato due dall'altro. Ovviamente dopo il primo giro ti devi cotruire due primer di sequenziamento per proseguire.
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 19:59:59
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Citazione:
Messaggio inserito da babilei
Anyra dice la cosa più giusta.
Hai il plasmide... sequenzia quello.
Non si tratta di dire la cosa piu' giusta o meno...si tratta di vedere che reagenti si hanno a disposizione 
e poi....Anyra, ha detto che gli amplificati di 300 bp li ha avuti...quindi e' come se avesse fatto una nested
Poi volevo dire a manuela83 di non dare per scontato che primers che su cDNA funzionano fanno altrettanto ovunque....a volte capita, e mi e' successo personalmente che con i cDNA avevi una bomba ma su genomico non si aveva MAI niente...anche facendo le capriole con la PCR tra temperature sali cicli etc... certo che su un plasmide dovrebbe essere piu' semplice magari aumentando il numero di cicli e cambiando le condizioni di reazione rispetto al cDNA
Manuela83 facci sapere  |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 22:05:01
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ho clonato diversi cDNA di quelle dimensioni, ti illustro la mia strategia che ricalca quanto molti hanno già detto, quindi quoto e riassumo:
-per sequenziare non usare i primer con cui hai amplificato l'inserto da clonare perchè il sequenziatore di solito non legge le prime basi, meglio usare i primer di sequenziamento universali forniti col plasmide (o disegnarli relativi alle estremità del plasmide.
-Disegnati primer interni al cDNA, col sequenziatore che abbiamo noi a disposizione non ci sogneremmo mai di sequenziare più di 600 bp in un unica reazione di sequenza (quando arrivo a 700 offro il caffè a tutti), fatti i conti e disegnali in modo da coprire l'intero cDNA (se è un cDNA lo trovi su pubmed)
-Piuttosto che amplificare e sequenziare il cDNA dal plasmide, in modo da evitare errori introdotti dalla taq (succede anche con la hi-fidelity della roche) fai diverse reazioni nelle quali ci metterai come stampo il plasmide.
-incrocia le dita
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il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 10 settembre 2008 : 23:44:32
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| morgan79 ....mi sorge una curiosita' ,con chi lavori? |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2008 : 12:45:00
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| al farmacobiologico, tu? |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1915 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2008 : 13:39:48
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| io al policlinico con il prof. Papa |
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morgan79
Utente Junior
Prov.: Bari
143 Messaggi |
Inserito il - 11 settembre 2008 : 21:38:04
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fantastico, i nostri capi hanno lo stessmo maestro (ci crocefiggeranno per essere andati così OT) |
il sapere non è sufficiente, bisogna applicare; il volere non è sufficiente, bisogna fare |
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Discussione |
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amplificazione inserto
Didattica
