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kurtina
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
 Inserito il - 12 settembre 2008 : 10:25:25
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Salve a tutti. Una volta che nella produzione di anticorpi monoclonali ho individuato, mediante screening (tipo ELISA), gli ibridomi che mi interessano, devo ovviamente clonarli.
Il mio professore ha illustrato 3 tipi di clonazione:
- clonazione per diluizione
- clonazone in agar soffice
- clonazione in agar a bassa concentrazione
Per le prime due tutte a posto ma per l'ultima non riesco a capire tutto il procedimento.. Qualcuno me lo può spiegare in modo dettagliato descrivendo tutti i passaggi che devo fare?
Grazie
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
 Inserito il - 12 settembre 2008 : 10:57:35
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Io conosco il procedimento di clonazione per diluizione, ma non
so se si possa applicare agli ibridomi: crescono in sospensione, no?
Se fossero adesi alla superficie di coltura, si dovrebbe seminarli
in una quantità relativamente piccola (io facevo 50 000 cells/ml
in una petri da 10) facendo in modo di separare bene ogni cellula
dall'altra, ad es. agitando la piastra con movimenti a croce.
In questo modo ogni cellula isolata può dare origine a isolette
monoclonali, che devono essere tenute sotto osservazione e quindi
"piccate" (picking) con un puntale al momento giusto, cioè prima
che arrivino a toccarsi l'una con l'altra.
Immagino che usando l'agar si possa limitare la diffusione
di cellule in sospensione e quindi arrivare alla possibilità
di sottoporle a questo medesimo procedimento. Però non lo so.
Non l'ho mai fatto né visto fare. |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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kurtina
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 11:27:26
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ti scrivo più o meno quello che ho scritto negli appunti:
-preparare delle piastre Petri con cellule feeder.
-aspirare tutto 1 litro medium (cosa vuol dire??)
-sciogliere agarosio al 3% facendo bollire e aggiungere 4ml a 50 ml di medium completo (cos'è questo medium??) prescaldato a 42°C e tenerlo in un bagno termostatato: questa è la soluzione A.
-versare 4ml di soluzione A in ogni piastra e mettere in camera fredda per 2-3 minuti per far solidificare l'agar
-contare le cellule da clonare e diluire va 3-6000 per ml in medium completo (passaggio che mi è poco chiaro...)
-mescolare rapidamente 0,3 ml delle cellule diluite con 0,7 ml della soluzione A e versare immediatamente sullo strato di agarosio solidificato. Il numero di cellule nella piastra petri è indicativo; andrà variato secondo la cloning efficency (che cos'è??) dei vari ibridi in modo da ottenere un numero sufficente di cloni ma ben spaziati tra loro. Sempre meglio fare due diluizioni. Le cellule da clonare devono essere in fase esponenziale di crescita.
-Appena il secondo strato di agar è solidificato mettere in incubatore e dopo un paio di giorni controllare la crescita dei cloni
-Overlay (cosa significa??) con anti Ig. Dopo 3-4 giorni stratificare sopra i cloni 1ml della soluzione A contenete antisiero di coniglio anti Ig topo diluito 1:5
-Il giorno dopo i cloni positivi (alone di precipitazione) vengono aspirati cn una pipetta a punta fine sotto il microscopio e posti in pozzetti Costar a 24 wells (cosa sono??) contenenti circa 200 cellule di feeder.
Ti ringrazio in anticipo. |
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la_fra
Utente
750 Messaggi |
Inserito il - 12 settembre 2008 : 22:44:35
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-medium= terreno di coltura
-contare le cellule e diluirle a 3000-6000 per ogni ml di terreno che hai (perchè poco chiaro?)
-cloning efficiency= in questo caso si intende che un singolo ibridoma può avere una maggiore o minore capacità di generare cloni, perciò il numero di cellule che dovrai mettere sarà minore se gli ibridomi hanno una buona efficienza, sennò i cloni che si formano nell'agar sono troppi e non puoi distinguerli come singoli, se l'efficienza è bassa devi seminarne di più sennò sono troppo pochi.
-overlay= ricoprire
- 24 wells = piastra da 24 pozzetti!
scusa ma come fai ad avere isolato gli ibridomi e non sapere le cose + di base di laboratorio..?
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Doctors are men who prescribe medicines of which they know little, to cure diseases of which they know less, in human beings of whom they know nothing (Voltaire) |
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kurtina
Nuovo Arrivato
29 Messaggi |
Inserito il - 13 settembre 2008 : 10:54:12
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Perchè sto studiando il tutto in teoria per prepararmi a un esame. Non faccio nulla in pratica.  |
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Discussione |
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si parla di anticorpi monoclonali...
Didattica
