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Da
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 16 settembre 2008 : 15:24:29
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Ciao a tutti!!! Sto cercando di estrarre l'RNA da piastrine sortate, e quindi purissime, ma non ne vengo a capo!!! Per avere una quantità di RNA detectabile devo partire da troppi milioni di piastrine, non mi bastano i 20 ml che posso prelevare ai pazienti!!!!! Aiuto!!! grazie da
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 16 settembre 2008 : 16:54:47
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io non l'ho fatto da piastrine, ne' tantomeno da cellule sortate. ho lavorato su cellule fissate, ma estraevo l'RNA da 100-150 cellule.
per aumentare la resa ho usato un kit di estrazione su colonna e tutti i crismi per l'RNAsi! e' difficile ma ce la puoi fare.
per curiosita', da quante piastrine parti? |
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Da
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 08 ottobre 2008 : 14:52:06
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ciao elly,
anche io uso un kit con colonnine, anche se non ne esiste nessuno validato per le piastrine lo adatto ugualmente. Ho estratto RNA da 15000 di piastrine sortate e non ne è uscito niente!!! considera che le piastrine hanno quasi 100000 volte meno RNA dei leucociti!!! |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2008 : 08:45:19
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| Sinceramente non so nulla di piastrine, ma noi estraiamo RNA da tessuto adiposo e vi assicuro che anche lì è stato faticoso con i vecchi metodi,poi abbiamo usato le colonnine della qiagen dedicate. Provate a chiedere ai rappresentanti se ve ne danno in omaggio da provare ed utilizzate quello che vi fornisce una resa più alta.Abbiate l'accortezza di ripassare l'h2o in colonna, alla fine per l'eluizione dell'RNA almeno 2 volte, nel senso che la riprendi dalla provettina finale e la ributti in colonna. |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2008 : 09:46:10
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si' in effetti fatte le dovute proporzioni (mi fido dei dati che mi hai dato), sei veramente basso con l'RNA. se non riesci ad avere piu' materiale di partenza potresti provare a aggiungere la soluzione di lisi e congelare il campione. rifai l'esperimento piu' volte. poi estrai tutto l'RNA con le colonnine (una per campione), eluisci, unisci tutte le soluzioni e riduci il volume della soluzione con una pompa a vuoto... puo' aver senso?
ma poi, che ci devi fare con questo RNA? se mi dici il passo successivo magari non serve far tutto questo casino! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 09 ottobre 2008 : 12:53:48
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Io direi che la parola "detectabile" è relativa... con quale tecnica lo fai?
Se è un gel di agarosio potresti avere dei problemi a scendere al di sotto di una certa soglia anche se è ancora una quantità accettabile per una retrotrascrizione ed amplificazione per Real Time.
Se non ti serve fare una analisi di maggiore o minore espressione, ma solo una analisi qualitativa potresti retrotrascrivere la minima quantità che hai e vedere se la riesci ad amplificare. Ovviamente ti serve un controllo interno sempre presente per essere sicuro che l'RNA l'hai estratto bene.
in bocca al lupo
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Da
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 15:19:08
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| Dopo l'estrazione lo misuro con uno spettrofotometro molto sensibile ma raramente viene rilevato!!!! Cmq devo revertare almeno 100 ng per fare la real time! |
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elly_
Utente Junior
400 Messaggi |
Inserito il - 21 ottobre 2008 : 18:22:39
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| allora l'unica cosa che mi viene in mente da fare è come ho detto io. avevo problemi analoghi ai tuoi ma facendo così sono riuscita anche a fare la real-time. è un po' lungo e macchinoso ma puoi farcela... ciao! |
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RNA da piastrine
Didattica
