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lucybiotec
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
 Inserito il - 18 settembre 2008 : 19:32:40
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salve!ho un problema col gel di agarosio e il transilluminatore...quando vado alla macchina per visualizzare il gel, lo stesso risulta diviso in due, la parte inferiore è nera e la superiore è bianca, il marker si vede anche se non nitido e il campione si vede molto molto sfuocato solo nella parte superiore.qualcuno sa dirmi il perchè? il tae è stato preparato fresco, quindi non uò essere, l'etidio non è scaduto....mi aiutate? grazie!
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Dionysos
Moderatore
Città: Heidelberg
1913 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2008 : 21:02:40
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Il motivo sta nella carica positiva dell'etidio, che tende a migrare verso il catodo (-),
così risulta "colorata" tutta la parte superiore e "buia" quella sotto, perchè c'è un
addensamento vicino al polo negativo. In questi casi non puoi vedere il
DNA più leggero e rischi di distorcere la quantificazione delle bande più
alte a scapito di quelle più basse.
L'unica soluzione è farlo correre di meno, in modo da non dare il tempo all'etidio
di spostarsi in massa verso il catodo: se devi separare bande che corrono
molto lente e che necessitano di una lunga corsa, piuttosto abbassa
la concentrazione del gel, mentre se le tue bande sono quasi invisibili,
alza la conc. di etidio (senza esagerare, che con l'etidio non è cosa) |
Volere libera : questa é la vera dottrina della volontà e della libertà
(F.W. Nietzsche)
Less Jim Morrison, more Sean Morrison!
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lucybiotec
Nuovo Arrivato
4 Messaggi |
Inserito il - 18 settembre 2008 : 21:30:49
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| grazie della risposta!mi spieghi un'altra cosa però? il giorno prima avevo caricato dei campioni su un gel da 1.5, nessun problema visualizzazione perfetta;il giorno dopo ne ho fatto uno da 0.8 e li sono iniziati i problemi con la visualizzazione che ti dicevo sopra; siccome, non vedendo il campione,sospettavo un'assenza dello stesso,ho rifatto il gel da 1.5 caricando i campioni del giorno prima e la visualizzazione non era più perfetta ma si vedeva male come il gel da 0.8.com'è possibile che mantenendo le stesse condizioni lo stesso gel il giorno prima si vede perfettamente e il giorno dopo no? grazie ancora |
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moonycinzia
Utente Junior
234 Messaggi |
Inserito il - 19 settembre 2008 : 13:56:19
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Citazione:
Messaggio inserito da Dionysos
Il motivo sta nella carica positiva dell'etidio, che tende a migrare verso il catodo (-),
così risulta "colorata" tutta la parte superiore e "buia" quella sotto, perchè c'è un
addensamento vicino al polo negativo. In questi casi non puoi vedere il
DNA più leggero e rischi di distorcere la quantificazione delle bande più
alte a scapito di quelle più basse.
L'unica soluzione è farlo correre di meno, in modo da non dare il tempo all'etidio
di spostarsi in massa verso il catodo: se devi separare bande che corrono
molto lente e che necessitano di una lunga corsa, piuttosto abbassa
la concentrazione del gel, mentre se le tue bande sono quasi invisibili,
alza la conc. di etidio (senza esagerare, che con l'etidio non è cosa)
Oppre puoi colorare il gel dopo averlo corso (sprechi pèiù EtBr ma se il risultato è importante ne vale la pena).
Quindi fai correre il gel senza EtBr, poi lo metti in vaschetta d'acqua con un20-40 ul di EtBr a seconda della grandezza del gel lo lasci 20 minuti dopo di che lo metti in acqua distillata altri 20 minuti e vai al transilluminatore.
la soluzione con l'EtBr puoi recuperarla e riusarla 2-3 volte.
Io i gel li faccio sempre così; lavorando con la topologia non si possono correre i gel già in EtBr! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 20 settembre 2008 : 20:52:36
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Esiste anche un'altra metodica, anche questa spreca molto etidio e va usata con cautela solo quando serve, consiste nel far correre il gel di agarosio con l'etidio bromuro in una soluzione di TAE o TBE alla stessa percentuale di etidio del gel.
In questo caso si possono far migrare le bande anche per molto tempo conservando un certo grado di uniformità di fluorescenza in tutte le zone del gel.
Ovviamente la soluzione del buffer può essere riutilizzata anche 2-3 volte e poi va gettato nei rifiuti speciali con etidio bromuro.
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d.goldy
Nuovo Arrivato
39 Messaggi |
Inserito il - 21 settembre 2008 : 21:03:04
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Ciao,
noi facciamo sempre come ha detto neuroscience.
Ma fallo solo quando quantifiche perché l'EtBr é veramente inquinante e cancerogeno.
Io personalmente preferisco il protocollo di moonycinzia e l'EtBr puó essere riutilizzato molte volte.
Giusto per farvelo sapere... noi usiamo delle colonne che legano l'EtBr cosi poi il filtrato si puo buttare via normalmente.
Bye Bye |
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marok
Utente Junior
150 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2008 : 08:54:10
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| E non dimentichiamoci che l'etidio è inattivato dal calore! |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 25 settembre 2008 : 19:12:04
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Citazione:
Messaggio inserito da marok
E non dimentichiamoci che l'etidio è inattivato dal calore!
Di questa cosa dubito molto, dato che da quando ero tesista fino ad ancora oggi preparo del gel con l'etidio in più e poi quello che non ci serve lo solidifico nel becker. Come me tutto il resto del dipartimento.
Il giorno successivo riscaldiamo il gel solido e lo versiamo senza altra aggiunta di etidio e funziona bene quanto quello fatto di fresco.
L'usanza di mettere l'etidio quando l'agarosio bolle, secondo la mia personale opinione, è legata al fatto che l'etidio è molto volatile, per cui può allontanarsi con l'evaporazione.
Se provi a solidificare e riscaldare più volte il gel con l'editio noterai che non si disattiva, se hai cura di coprire il becker.
Io in genere aggiungo l'etidio addirittura appena l'agarosio finisce di fare bolle (circa 100°C) e non succede assolutamente nulla.
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2008 : 12:13:47
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Anche io ho sempre usato la medesima metodica e l'etidio non ne ha mai risentito.
Certo, se lo scaldi MOLTO, alla fine si decompone. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2008 : 14:35:26
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| mha... io non e' che ci credo tanto che questo etidio evapora subito,cioe' ha una temperatura di ebollizione di 260 °C e sicuramente non si arriva a questa temperatura con i nostri gel,magari non evapora per niente ... o pochissimo,e sicuramente non si degrada con l uso che ne facciamo... piu' che altro mi chiedo se si rimuove facilmente da sopra la pelle nell eventuale contaminazione |
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Gabriele
Utente
Prov.: Pisa
Città: Pisa
615 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2008 : 16:09:39
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| Non evapora però la polvere ,essendo abbastanza fine, crea facilmente aereosol. |
"Chi rinuncia alla libertà per la sicurezza, non merita né la libertà né la sicurezza. E finirà col perdere entrambe." |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 26 settembre 2008 : 18:42:31
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Citazione:
Messaggio inserito da Gabriele
Non evapora però la polvere ,essendo abbastanza fine, crea facilmente aereosol.
be si ,mi riferivo alla soluzione che carico nel gel.... io lo frego in altri laboratori gia' fatto perche' mi scoccia  |
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Anyra
Utente Junior
Prov.: Pesaro-Urbino
Città: Saltara
212 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 12:28:31
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La soluzione evapora a 100 °C in quanto è sciolto in acqua e sebbene non porta con se medesime quantità di solutop va d ase che un po di EB evapora e, a meno che non lo si faccia scaldare sotto cappa chimica in funzione se ne respirano i fumi, e a lungo andare non fa bene.
Pensate anche al "fumo passivo" per chi gel non ne fa e se ne respira comunque una dose con il passaggio del gel che sta bollendo con tanto di EB dentro.
Date retta a me:
L'Etidio è teratogeno, meno se ne respuira e meglio è,
Lavorate sempre con il gel caldo e Etidio sotto cappa.
Ciao |
Il mio Cavaliere
http://s4.battleknight.it/index.php?loc=hire&ref=OTA3NTAw |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 14:13:36
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guardate quihttp://www.molecularlab.it/protocolli/reagent.asp?name=Etidio%20bromuro
e quihttp://www.molecularlab.it/protocolli/protocol.asp?id=31
Provate a fare un gel senza mettervi etidio bromuro nella beuta che usate solitamente( naturalmente dopo averla lavata), poi seminate dei campioni e andate a visualizzarli al transilluminatore, vedrete che appariranno delle bande, questo per dirvi che non è molto facile liberarsi dell'etidio una volta che ne foste venuti a contatto.
Usate sempre i guanti e lavorate sotto cappa e rompete le scatole se gli altri non lo fanno. C'è in qualsiasi posto un organo che sovraintende alla salute di coloro che vi lavorano, rivolgetevi ad esso, basta una telefonata e se non volete esporvi in prima persona fate una lettera.
Siete tutti giovani, ne avete ancora tanta di strada da fare, non respirate quelle schifezze. Le aziende stesse stanno cercando soluzioni diverse come il syber safe da poter sostituire l'etidio. Proponetele in laboratorio. |
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Patrizio
Moderatore
Città: Barcellona
1914 Messaggi |
Inserito il - 29 settembre 2008 : 14:30:08
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Anyra...se l H20 bolle a 100 gradi ... non vuol dire che la soluzione del gel con l etidio vada in ebollizione a 100 °C ,dovrei farei i conti ....ma non mi va,cmq si, ti do ragione che nei vapori ci sono tracce di etidio....
Cin il syber safe ...fa un po' schifo sinceramente,con tanto di versadoc non si vedono le bande flebili pero' in genere secondo me va bene |
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cin
Utente Junior
Prov.: Padova
Città: Padova
558 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 12:54:39
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| Io l'avevo provato qualche anno fa e sono tornata all'etidio, però hanno detto che è stato migliorato e che mettendo il gel in frigo l'intensità del segnale aumenta. |
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Neuroscience
Utente
659 Messaggi |
Inserito il - 30 settembre 2008 : 17:02:50
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Io ne ho provato uno ultimamente ma colorava malissimo ed in modo diversificato le bande piccole (molto intense) e grandi (praticamente invisibili), per fortuna sono riuscito poi a colorarlo con l'etidio e recuperare l'esperimento.
Quando ci sarà qualcosa che effettivamente sarà meglio dell'etidio bromuro vedremo introdurlo in tutti i laboratori come una rivoluzione, per ora non ho visto nessuno cambiare.
il SyberSafe come altri intercalanti non pericolosi non possono essere utilizzati per quantizzare per ora, poiché il loro grado di interagire con il DNA dipende dalla sequenza del DNA stesso e dalla concentrazione in uso. Speriamo in un futuro prossimo che qualcuno introduca una tecnica ancora più efficiente e meno tossica per evidenziare il DNA.
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saras
Nuovo Arrivato
Città: como
27 Messaggi |
Inserito il - 14 ottobre 2008 : 20:18:42
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Ciao a tutti
io uso il "GelRed"della Biotium.. non è cancerogeno come l'etidio bromuro e si puo' smaltire facilmente..... |
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aiuto...transilluminato e gel di agarosio!
Didattica
