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antimo
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16 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2008 : 13:26:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di antimo Invia a antimo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
salve ragazzi ho un problema nella risoluzione di una Immunoprecipitazione,allora quando faccio ECL per visualizzare la mia proteina immunopr. non la vedo perchè corre alla stessa altezza delle bande leggere dell'anticorpo(rabbit)
Ho letto che se carico il campione di IP con loading buffer non riducente dovrei evitare che la banda leggera e pesante dell'anticorpo si dissocino, e quindi dovrebbe correre di meno, e non mascherare più la mia proteina.
Avete altre idee'
avete mai avuto questo problema?

Iside
Utente Attivo

Iside_paradise

Città: Napoli


1375 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2008 : 13:44:46  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Iside  Invia a Iside un messaggio Yahoo! Invia a Iside un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
io ho avuto un problema simile. in genere cmq quando si fa un'immunoprecipitazione è bene usare 2 diversi cloni anticorpali, in modo da non avere problemi di sovrapposizione di bande. un anticopro (ad esempio anti-mouse) lo usi per precipitare e un altro (un anti-rabbit) lo usi per le incubazioni. solo che a volte non ci sono due diversi anticorpi per la stessa proteina, quindi in quel caso cerca di correre il gel quanto più puoi, cos' ti aumenta la risoluzione oppure corri un gel grande.

...we're just two lost souls swimming in a fishbawl...year after year...
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antimo
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16 Messaggi

Inserito il - 19 settembre 2008 : 13:52:37  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di antimo Invia a antimo un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
infatti pensavo di farlo correre di più, non posso fare l'IP e il WB con diversi anticorpi perchè come dici tu non ci sono, noi purtroppo abbiamo tutti anticorpi non commerciali visto che lavoriamo su archeobatteri.
Ma è vero il discorso delle catene leggere e pesanti dell'Ab?
ho visto una figura che descrive i legami di interazione tra le catene proprio fatti da ponti disolfuro quindi, il loading buffer non riducente dovrebbe lasciare unite le catene e shiftare la corsa
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Neuroscience
Utente



659 Messaggi

Inserito il - 20 settembre 2008 : 20:57:41  Mostra Profilo  Visita l'Homepage di Neuroscience Invia a Neuroscience un Messaggio Privato  Rispondi Quotando
Un'altra possibilità potrebbe essere l'utilizzo di un crosslinker. Forma dei legami crociati tra DNA e filtro di nitrocellulosa, e tra proteine e proteine quando sono abbastanza vicini.
In quel caso se fai un crosslink dell'IP non hai più bisogno di utilizzare un buffer non riducente, in quanto i complessi formati dalle proteine prima dell'IP non si possono dissociare più.
Questo potrebbe funzionare a patto che l'anticorpo di cui parli si dissocia solo durante la corsa e che non esageri con il crosslink altrimenti l'anticorpo secondario rischia di non riconoscere più l'antigene.

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