Estrazione di proteine da cellule eucariotiche
Descrizione
Una metodica per estrarre le proteine da cellule in coltura, passaggio iniziale ad esempio per l'analisi in Western Blotting.
Lavorare sempre in ghiaccioPer cellule aderenti:Lavare le piastre 2 volte con PBS w/o Ca++ e Mg++Aggiungere 500 µl di cocktail di inibitori delle proteasi (per una piastra da 10 cm) e staccare le cellule usando uno scraper.Raccogliere il liquido in una provetta da 1.5mlPer cellule in sospensione:Centrifugare le cellule in sospensione per 15' a 3200 rpm, in modo da far precipitare le cellule.Lavare il pellet con PBS w/o Ca++ e Mg++ e ricentrifugare brevementeRisospendere il pellet in 500 µl di cocktail di inibitori delle proteasiProseguire con questi passaggi in entrambi i casi:Centrifugare 5' a 3000 rpm a 4˚CRisospendere il pellet in 40 µl di cocktail di inibitori delle proteasi + 1% IgepalLasciare in ghiaccio 15'Centrifugare per 15' a 12000 rmp a 4˚CTrasferire il surnatante contenente le proteine in un altra provettaDosare le proteine con il metodo preferito
