Sintesi di probe radioattiva per in situ
Descrizione
L'in situ hybridization permette di localizzare la presenza di un particolare mRNA in un certo tessuto, tramite una probe marcata, ad esempio radioattivamente.
Questo protocollo richiede l'utilizzo di materiale radioattivo e quindi tutti i passaggi devono essere eseguiti in un ambiente opportunamente predisposto. È buona norma tenere un contatore Geiger sull'area di lavoro per controllare che nei vari passaggi non ci siano state perdite di materiale radioattivo.Lavorare in ambiente RNAsi-free.
Tutte le soluzioni devono essere trattate con DEPC prima dell'autoclavatura o, se non sono autoclavate, fatte con DEPC - H2O.Clonare la sequenza desiderata in un plasmide contenente promotori per due diverse polimerasi alle due estremità del polylinker (es. pCDNAI con T7 e SP6). Questo permetterà di ottenere sia la probe antisenso che ibriderà con l'mRNA sia la probe senso, usata come controllo negativo. Assemblare i seguenti reagenti (a T ambiente):
1 µl buffer di trascrizione per RNA polimerasi
1 µl DTT 0.1M
2 µl NTP (solo A, C e G)
0.5 µl di templato 1 µg/microl (=500 ng) linearizzato all'estremità 3' o all'estremità 5', a seconda di quale polimerasi si vuole utilizzare)
4 µl di DEPC - H2OTrasferire questa mix in una provetta contenente 250 µCi di 35S dUTPVortexare brevemente e centrifugare velocemente.Aggiungere 0.5 µl di RNAsin (20 U)Aggiungere 1 µl di RNA polimerasi (SP6 o T7 a seconda se si sta sintetizzando senso o antisenso).Incubare 1h a 37ºCAggiungere altri 0.5 µl di polimerasi e incubare 30' a 37ºCDigerire con DNAsi (1U / µg di templato) per 15' a 37ºCPurificare su colonna (es. con Ambion QuikSpin) Consiglio
Annotare quanti µlitri sono stati recuperati dopo filtrazione!
Rimuovere 1 µl di filtrato in duplicatoPortare a 100 µl con TEPrecipitare con 1/10 di volume (10 µl) di NaAc 3M e 2 volumi (200 µl) di Etanolo a -80º overnight.Con uno scintillatore eseguire una conta dei due µl di probe prelevati in modo da poter risalire alla quantità totale di cpm nella provetta, moltiplicando la media delle due conte per il volume eluito dalla colonna. Una buona reazione dà attorno ai 450-500000 cpm/microl.Consiglio
È possibile mantenere le probes a -80º fino al momento dell'uso. Se si conservano per molto tempo è utile rifare la conta prima dell'uso per accertarsi che ci sia abbastanza radioattività residua (emivita del 35S è di circa 90 giorni)
Prima dell'uso centrifugare 30' a 4ºC, sciacquare il pellet con Etanolo 70% e lasciare asciugare.Risospendere in TE alla concentrazione desiderata (determinata dai cpm).
