La proteina di nostro interesse non ha struttura nota. Si cerca lo stampo per effettuare il modelling lanciando BLAST (proteina verso proteina) contro il server PDB, usando come query la sequenza fasta della proteina di nostro interesse (che chiameremo d’ora in poi query). Si scarica il file PDB della proteina ritenuta lo stampo migliore dal sito del ProteinDataBank www.rcsb.org (che d’ora in poi chiameremo stampo)

Si carica il file .pdb della proteina stampo su SwissPdbViewer: File --> Open PDB File. Si genera la sequenza fasta dalla struttura caricata sul programma tramite: File --> Save --> Sequenze (FASTA).
Si effettua un allineamento binario fra la sequeza FASTA dello stampo e la sequenza FASTA della proteina query, tramite uno dei tools reperibili su expasy.

Torniamo su SwissPdbViewer.
Da Window si può aprire il ControlPanel che ci permetterà di evidenziare o meno le catene laterali, di colorare i residui a piacere e tante altre cose.

Apriamo con DeepViewer il file pdb della proteina stampo. Carichiamo la proteina query: SwissModel --> Load Row Sequence to Model che deve essere in file di testo ed in formato FASTA:
>nomeproteina
ASDHKLPYNVCDFGR….

Window --> Alignment ci permette di aprire la finestra in cui effettueremo l’allineamento, per farlo seguiremo passo passo l’allineamento fatto precedentemente tramite i tools di expasy.

Una volta allineata, la sequenza della proteina query assumerà la forma della proteina stampo. Togliere a questo punto le eventuali parti N-Term e C-Term che non sono considerate nell’allineamento.

Salvare il progetto: andando sul ControlPanel si seleziona la proteina query poi da Select --> Select All si selezionano tutti gli aminoacidi, poi si ripete l’operazione anche per la proteina stampo. Una volta selezionato il tutto si va su File --> Save Project ….il file dovrà avere l’estensione .prj.

Dal ControlPanel si seleziona il file .pdb della proteina stampo. Si chiude il file pdb File --> Close. Salvare il file pdb della proteina query Select --> Select All , File --> Save Layer questa volta l’estensione sarà .pdb

Si chiude DeepViewer. Si riapre DeepViewer e si apre il file pdb salvato (se è stato fatto tutto bene si aprirà la struttura della proteina query; altrimenti aprire il file .prj e rifare i passi successivi)

1) Controllare la presenza di eventuali gap (buchi) nella sequenza. I gap sono presenti a causa dell’allineamento che avete effettuato: se nell’allineare query con stampo avete inserito uno spazio, avete generato un gap nella struttura! Utile, in questo passaggio, è avere a portata di mano l’allineamento fatto fra query e stampo, così da avere ben chiara la posizione dei gap. Si presentano 2 casi: gap nella query e gap nello stampo. Un gap nella query si vede perché avete 2 aminoacidi consecutivi non legati con legame covalente. Un gap nello stampo crea una zona di incertezza sulla struttura della proteina query. I residui della query corrispondenti a un gap nello stampo sono assenti o, se presenti, hanno struttura arbitraria (come impostato di default da DeepViewer). I residui della query corrispondenti a gap nello stampo andranno selezionati sul Controlpanel (diventano rossi) e rimossi da Build --> Remove selected residues.
2) Riaggiungere i residui tolti Build --> Add residue cliccare sull’atomo di carbonio (bianco) comparirà la tabellina con tutti i residui, aggiungere via via quelli che si erano tolti in precedenza.
3) A questo punto si deve lavorare manualmente sula struttura. Dobbiamo generare un modello della proteina query e quindi si devono “chiudere i gap”, cioè si devono legare gli aminoacidi consecutivi che non sono legati fra loro. Bisogna chiudere gli spazi all’interno del BackBone, per vedere i vari problemi Color --> By Protein problems. I problemi strutturali saranno visualizzati in arancione sul backbone. Selezionare sul Control panel la parte C terminale in ciano e quella N terminale in Magenta. Selezionare tramite il ControlPanel solo i residui colorati e aprire da Window --> RamachandranPlot stare attenti a selezionare in alto al quadrato C o N a seconda della parte che si vuole muovere (se per caso muovete la parte sbagliata distorcete l’intera struttura…DeepViewer fa annullare solo 1 movimento, se ne avete fatti più di uno dovete ripartire dall’ultimo salvataggio). Una volta raggiunta la distanza desiderata (sotto 2 Å) (stare attenti di legare Carbonio con Azoto per questo conviene rendere invisibili gli ossigeni del backbone Display --> Show backbone oxygens) Build --> Ligate BackBone salvare ad ogni passaggio.
Una volta aggiustati i gap è preferibile sottoporre il modello a minimizzazione energetica (GROMACS o AMBER).