Innanzitutto bisogna trovare sequenza del gene per il quale si vuole disegnare la sonda. Le sequenze dei geni sono raccolte nel database “GeneBank”, tuttavia questo database contiene molte sequenze ridondanti e potrebbe essere difficile trovare tutte le sequenze disponibili per il gene di interesse e scegliere la migliore.

Per questo può essere utile partire dal database “UniGene”, questo database è una raccolta di sequenze di GeneBank raggruppate per organismo e gene. Vengono date tutte le sequenze in una sola entry con i links alle entries in GeneBank. Se non si trova il gene in UniGene bisogna comunque cercarlo in GeneBank. Bisogna anche tener presente che i nomi dei geni possono cambiare dopo la loro scoperta e potrebbe essere necessario ricercare nelle pubblicazioni i nomi alternativi del gene.

Una volta trovate le sequenze per il gene di interesse bisogna cercarne una con una dicitura come “…mRNA, complete cds”, questa generalmente contiene la sequenza completa dell’mRNA che può essere utilizzata per disegnare la sonda. Se non c’è questa sequenza bisogna usarne una della altre disponibili. Se è una sequenza genomica probabilmente contiene introni, promotore o altre sequenze non trascritte. È necessario rimuovere o segnare queste parti in modo che da non disegnare sonde in quelle regioni.

È meglio localizzare le sonde nella regione del “CDS” (sequenza codificante) o vicino ad essa.

È buona regola anche cercare nelle pubblicazioni se sono note forme di splicing alternativo per il gene di interesse. Nel disegno delle sonde è preferibile utilizzare solo gli esoni che sono presenti in tutte varianti di splicing. È difficile individuare particolari varianti di splicing con l’ibridazione in situ, quindi è meglio se le sonde le legano tutte.

Caratteristiche generali sonde per l’ibridazione in situ:

1. La sequenza della sonda deve essere complementare (!!!) alla sequenza in gene bank

2. Deve essere lunga almeno 30 nucleotidi.

3. Dovrebbe avere una percentuale di GC del 45-60%. Se la percentuale di GC è inferiore del 45% bisogna allungare la sonda di alcuni nucleotidi.

4. Non dovrebbe contenere più di 3 G e più di 4 C in fila (non molto importante e non sempre possibile).

5. Sonde per lo stesso target non devono essere sovrapposte.

Dopo il disegno iniziale bisogna controllare che la sonda non abbia similarità con altre sequenze utilizzando Blast, che compara la sequenza della sonda con tutte le sequenze presenti nel database. La sonda non deve avere più di 25-27 nucleotidi su 32 identici ad un altro gene che non sia quello di interesse. Cercare di trovare sonde che abbiano la minor similarità possibile con altre sequenze.

Alcuni suggerimenti:

Se non si trova nessuna sequenza in Gene bank, controllare il nome del gene. Spesso i geni hanno diversi nomi alternativi.

Se ci sono sequenze molto simili a quella di interesse, si possono allineare per cercare le regioni in cui differiscono (utilizzando programmi di allineamento come ad es. ClustalW).

Le sonde possono essere disegnate manualmente, ma ci sono anche programmi per il disegno di primer che possono essere utilizzati anche per le sonde. (x es. Primer3)

I programmi in genere calcolano la percentuale di GC e cercano anche se nella sonda si possono formare strutture secondarie o dimeri.