Titolazione per CPE50
Descrizione
Titolazione virale sulla base dell'effetto citopatico: si trova la concentrazione alla quale il virus causa il 50% di effetto citopatico sulle cellule
Piastrare le cellule in piastre da 96 (8x12), quando sono a confluenza (non totale) si infetta. L'infezione va fatta con varie diluizioni di virus: diluizioni seriali che arrivano fin dove serve (ad esempio 10^-8, ma per virus particolarmente concentrati va bene anche andare oltre).Infettare con il virus ogni colonna. In ogni pozzetto delle piastre da 96 ci va fino a 100 µl, quindi per star sicuri si devono preparare almeno 1.8 o 2 ml di virus per ogni diluizione (diluizione che va fatta nel terreno di coltura), perché la cosa va fatta in doppio.Per non rischiare di inquinare il pozzetto successivo, cambiare punta ad ogni diluizione. Il lavaggio prima dell'infezione è facoltativo. Si dividono le colonne da 8 pozzetti in due gruppi da 6 colonne (tipicamente che vanno da 10^-3 a 10^-8), in modo da avere appunto i doppi, dividendosi la piastra in due. Come puoi capire, per ogni punto dell'esperimento va usata una piastra completa (ad esempio, se hai 4 tempi devi piastrare e infettare 4 piastre). I risultati si leggono dopo 36-48hLettura dei dati. Ogni colonna avrà una certa quantità di pozzetti con effetto citopatico, tipicamente a 10^-3 l'avranno tutti, a 10^-8 pochi o nessuno. Se si trova una concentrazione virale a cui tutti e due i duplicati risultano 4 pozzetti su 8 il titolo della CPE50 è quella concentrazione, cambiando di segno all'esponente (se la diluizione è 10^-6 il titolo è 10^6). Altrimenti va calcolato.
Ci si segna su un pezzo di carta due colonne: una per la diluizione (10^-3, 10^-4...) e uno per i pozzetti trovati con effetto citopatico, ad esempio:
10^-3 || 8/8
10^-4 || 8/8
10^-5 || 6/8
10^-6 || 3/8
10^-7 || 1/8
10^-8 || 0/8
Fatto questo si fanno altre due colonne, una che mostra quanti pozzetti hanno effetto citopatico e una che mostra l'opposto, cioè quanti pozzetti non mostrano effetto citopatico. Nel nostro esempio:
+ || -
8 || 0
8 || 0
6 || 2
3 || 5
1 || 7
0 || 8
Ora bisogna fare delle somme. Per fare queste somme si rifanno le famose colonne: una che mostra le diluizioni, partendo dal basso all'alto, l'altra che fa la somma dei negativi; inoltre si aggiungono altre due colonne, una che mostra le diluizioni, partendo stavolta dall'alto al basso e una la somma dei negativi. Seguendo l'esempio:
Dil || Som + |||| Dil || Som -
10^-8 || 0 |||| 10^-3 || 0
10^-7 || 1 |||| 10^-4 || 0
10^-6 || 4 (1+3) |||| 10^-5 || 2
10^-5 || 10 (4+6) |||| 10^-6 || 7 (2+5)
10^-4 || 18 (10+8) |||| 10^-7 || 14 (7+7)
10^-3 || 26 (18+8) |||| 10^-8 || 22 (14+8)
Si scrivono così perché si sommano le prime dal basso, e le seconde dall'alto.
A questo punto possiamo renderci conto delle percentuali di effetto citopatico. Ancora tre colonne: la prima con le diluizioni, la seconda con il rapporto positivi/osservati, la terza con la percentuale. Il rapporto si ha confrontando i risultati ottenuti sopra, alla minima diluizione ho 26 pozzetti con effetto citopatico e 0 senza, quindi ho 26/26, alla terza, ad esempio (10^-5) ho 10 pozzetti con effetto citopatico e 2 senza, per un totale di 12 pozzetti osservati, quindi 10/12. Seguendo l'esempio:
Dil || Pos/Oss || %
10^-3 || 26/26 || 100%
10^-4 || 18/18 || 100%
10^-5 || 10/12 || 83.3%
10^-6 || 4/11 || 36.4%
10^-7 || 1/15 || 6.7%
10^-8 || 0/22 || 0%
A questo punto c'è una formula: (percentuale > di 50% -50)/(percentuale > di 50% -percentuale < 50%), nel nostro esempio (83.3-50)/(83.3-36.4)=0.71
Questo 0.71 lo sommiamo a 5, in quanto 5 è l'esponente della diluizione che ha dato il risultato immediatamente superiore al 50%, quindi abbiamo 5.71, questo numero lo usiamo come esponente di 10, quindi verrà 10^5.71, che equivale a 5.12x10^5 e quello è il nostro titolo espresso in PFU (Plaque Forming Unit).
