ISOLAMENTO DI CELLULE MONONUCLEATE DA SANGUE PERIFERICO

Raccogliere il sangue con una siringa condizionata con eparina per evitare la coagulazione;

trasferire il sangue dalla siringa senza ago in una falcon premendo lo stantuffo molto lentamente per evitare la rottura delle cellule;

diluire il sangue secondo i rapporti 1:1 o 1:2 con soluzione fisiologica risospendendo delicatamente;

in un’altra falcon mettere metà volume (rispetto al sangue) di Histopaque (Sigma) a temperatura ambiente;

aggiungere lentamente al di sopra dell’Histopaque un volume di sangue diluito molto lentamente in modo che le due soluzioni restino separate;

centrifugare a 1500 rpm per 30 minuti a 25° C con un’accelerazione pari a 1 e decelerazione pari a 0;

al termine si dovrebbero vedere 4 fasi (al di sotto i globuli rossi, appena sopra l’Histopaque, un sottile anello di cellule mononucleate e al di sopra di tutto il siero);

con l’ausilio di una p1000 aspirare l’anello di cellule facendo delicatamente movimenti circolari lungo il perimetro interno della falcon (per aspirare uniformemente l'anello di cellule) e facendo attenzione a non aspirare nient’altro, in special modo i globuli rossi sottosanti;

trasferire tutto l’aspirato in una falcon e portare a 50 ml con soluzione fisiologica e risospendere delicatamente;

centrifugare a 1500 rpm per 15 minuti con accelerazione pari a 6 e decelerazione pari a 5, a 25° C per lavare;

eliminare il surnatante;

portare a 50 ml con soluzione fisiologica e risospendere delicatamente;

centrifugare a 1500 rpm per 15 minuti con accelerazione pari a 6 e decelerazione pari a 5, a 25° C per lavare;

eliminare il surnatante e procedere alla conta nel seguente modo;

risospendere il pellet in 1 ml di terreno per colture cellulari di mammifero (varia al variare dello scopo del lavoro) e mantenerli a 4°C;

per la conta vera e propria prelevare dall’ultima risospensione 100 µl e aggiungerli a 2900 µl di terreno per colture cellulari di mammifero in una provetta da emocromo e farli contare in un laboratorio specializzato;

conto finale per la concentrazione in base alla diluizione fatta.
n° di WBC *1000= n° WBC/µl
n° WBC/microl *1000= n° WBC/microl
n° WBC/ml* 3= n° WBC/ 3 ml=> n° WBC/ 100 µl