Immunoprecipitazione di proteine
Descrizione
La tecnica consente di isolare una specifica proteina per eseguire un western blot. Per ottimizzare la procedura, è bene utilizzare due diversi cloni anticorpali: uno servirà per la reazione di immunoprecipitazione, l'altro, invece, per il blotting.
Tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4°C
Si parte da un pellet cellulare, ottenuto a seconda delle condizioni di crescita delle proprie cellule. Per cellule cresciute in aderenza, si esegue lo scraping in PBS e la centrifugazione a 2000 rpm a 4°C Aggiungere al pellet in eppendorf il buffer di lisi addizionato con gli inibitori delle proteasi. La quantità di buffer di lisi da aggiungere dipende dal volume del pellet Consiglio
in genere è sufficiente aggiungere un volume di buffer tre volte superiore al volume del pellet
Lasciare i campioni in agitazione per 30' in camera freddaCentrifugare per 10' a 14000 rpm in centrifuga refrigerataRaccogliere il surnatante (estratto) in eppendorf pulite e scartare il pellet. Prelevare una quantità di estratto sufficiente ad eseguire il dosaggio delle proteine e normalizzareIncubare l'estratto con l'anticorpo specifico per immunoprecipitare. Le quantità di anticorpo da utilizzare sono descritte nel data-sheet, in genere si utilizzano 1,5 ug di anticorpo/mg di proteine. Far procedere l'incubazione O.N. in camera fredda ed in agitazioneIl giorno seguente, aggiungete 30 ug secchi di proteina A/G plus Agarose ad ogni campioneFar procedere la reazione per 1,5-2 ore, in camera fredda ed in agitazioneAllo scadere delle 2 ore, centrifugare a 14000 rpm Eliminare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare la resina Lavare 3 volte la resina con 500 ul di buffer di lisi. ad ogni lavaggio, centrifugare e scartare il surnatanteAl termine dei lavaggi e dell'ultima centrifugazione, aggiungere 30 ul di Laemli Sample Buffer Bucare il tappo dell'eppendorf con un ago e bollire i campioni per 5' Consiglio
agitare di tanto in tanto i campioni
Centrifugare per 5' a 14000 rpm. raccogliere il surnatante e trasferire in eppendorf pulita, avendo cura di non prelevare anche la resinaEseguire il Western Blot
