Programma da utilizzare: ImageJ 1.41o; il programma è stato utilizzato da utenti Macintosh

a) Aprire con il programma Image l’immagine da esaminare e verificare che sia a 8 bit (menu image - type 8bit), ben sopportata: se fosse troppo grande e comparisse un messaggio di errore, allora eseguire la procedura seguente:
aa) aprire l'immagine con un programma di elaborazione immagini (come Photoshop), trasformare l'immagine in scala di grigio e ridurre a dimensioni compatibili con il sistema di analisi di immagine: per le precedenti versioni di Image è opportuno restare sotto i 600 kByte, l'ultima versione di ImageJ è in grado di trattare anche immagini di oltre 10 MB; salvare l'immagine modificata; riaprire l'immagine con Image.

b) Verificare che l'immagine sia con fondo scuro e segnale chiaro, come è tipico delle immagini in fluorescenza; in caso contrario, invertire l'immagine (menu Edit - Invert, oppure cmd-shift-I).

c) Regolare la scala dell’immagine a pixel (menu Analyze - Set Scale).

d) Scegliere le misure da effettuare (menu Analyze - Set Measurements: area, mean gray value - quest'ultima corrisponde alla densità media).

e) Misurare l’area della fotografia: si effettua moltiplicando i pixel fra loro (leggendoli in alto a sinistra nella immagine aperta) oppure dal menu Analyze - Measure, oppure cmd-M.

f) Misurare l’area del distretto da studiare: delimitare con lo strumento bacchetta magica o con un altro strumento geometrico l’area da misurare e poi misurarla: menu Analyze - Measure, oppure cmd-M.

g) Delimitare con lo strumento selezione rettangolare un'area in una zona di tessuto priva di segnale, da considerare come “fondo”, eseguire la misurazione (quella rilevante è qui la densità) e annotarla come "fondo". Per questa annotazione e per quelle successive, come pure per i calcoli, è adatto Excel.

h) Effettuare una sezione di densità dell’immagine (menu Image -Adjust - Thresold, oppure cmd-shift-T) regolando il margine superiore all’estremità del bianco (cursore in basso a fondo corsa a destra) e quello inferiore ad un valore pari a 1,5 volte il valore del "fondo" (cursore in alto). Se necessario, spuntare "dark background".

i) Misurare le aree comprese nella sezione di densità (menu Analyze - Analyze Particles), indicando una misura minima delle particelle da misurare sufficiente ad evitare eventuali artefatti da precipitazione granulare dei reagenti (il valore minimo può variare tra 5 e 50 pixel, a seconda della risoluzione dell'immagine), scegliendo l’opzione "Show Outlines" dal menu a tendina (che dopo la misurazione fa vedere il numero delle aree contate che corrispondono alle misurazioni effettuate: "Drawing") e spuntando "Display Results".

j) Salvare, con nome diverso rispetto all'immagine originale, sia la figura modificata dove vengono fatti vedere i conteggi sia quella dove viene fatta vedere la distribuzione del segnale all’interno del tessuto (cioè la sezione di densità).

k) Annotare i risultati, oppure salvarli o esportarli, a seconda della versione del programma; nella ultima versione, dal menu File - Save As il salvataggio avviene automaticamente in formato Excel, annotando anche il numero di particelle misurate.

l) Tramite Excel, valutare la soma delle aree cellulari (somma dei punti eccetto eventuali zone bianche perché prive di qualsiasi immagine).

m) Calcolare la densità integrale per ciascuna area marcata moltiplicando la media per l’area (N.B. è dato diverso dalla "Integrated Density" calcolabile da Image, menu Analyze - Analyze Particles).

n) Calcolare a questo punto la densità integrale totale sommando tutti i valori della densità integrale, e l'area marcata totale sommando tutti i valori dell'area marcata.

o) Per valutare l’intensità di marcatura media si divide la densità integrale totale per l’area marcata totale.

p) Per valutare l’area marcata totale per unità di superficie di tessuto si divide l’area marcata totale per l’area del distretto esaminato.

q) Per definire l'area totale osservata - quale misura del campione esaminato - si moltiplica il numero di pixel per l'area della superficie di sezione corrispondente a ciascun pixel. L'area della superficie corrispondente a un pixel si ricava dividendo l'area della figura intera (cioè l'area della microfotografia, misurata grazie a un vetrino di taratura millimetrato) per l'area in pixel quadri (desunta dalle misurazioni di ImageJ per l'intero campo immagine). Anche se si devono effettuare misurazioni che non siano semplicemente area/area, come ad esempio il conteggio del numero di strutture marcate per unità di superficie, occorre tener conto del rapporto tra pixel e misure effettive sul preparato.

Seguendo il metodo esposto i risultati sono ricavati per ciascuna immagine; questa può essere assunta come unità campionaria per l'analisi statistica, oppure possono essere raggruppate fra loro più immagini (ad esempio tutte quelle di un singolo soggetto o di un singolo esperimento). Con opportuni adattamenti, il metodo si presta anche per analisi su singole strutture marcate (ad esempio, per singole cellule).