Questo tipo di mutagenesi prevede conoscenze approfondite
della sequenza del DNA da mutare.
Abbiamo già
visto una mutagenesi sito diretta tramite PCR.
In qualsiasi mutazione sito diretta io posso apportare qualunque
modifica in qualunque posizione:
Introdurre una base;
Scambiare una base;
Togliere una base.
Estensione enzimatica del primer.
Posso farlo tramite PCR o utilizzando DNA circolare ss, dove ho
clonato il mio frammento di interesse, qns dal DNA ds si fa il ss
e da questo DNA con il YFG, si fa un oligo (di solito lunghezza
18-20 basi) che viene poi fosforilato in 5’. Questo oligo
deve contenere nella zona centrale la sostituzione che vogliamo
fare. Questo oligo si fa annealare al templato single strand (ci
sarà ovviamente una zona di MisMatch) si aggiunge polimerasi,
si aggiungo nucleotidi, e c’è la reazione di polimerizzazione
del secondo strand. Alla fine aggiungo la ligasi,
c’è un fosfato in 5’ e avrò quindi una
molecola circolare double strand. Con lo strand interno wild-type
e lo strand esterno con la mutazione (e quindi il MisMatch).
Trasformo E.coli, replicazione, seleziono su Amp, mi aspetterei
di avere un 50% wild-type e un 50% mutati, questo in teoria. In
pratica trovo in genere che solo un 20% possiede la mutazione. Questo
perché E.coli possiede un suo sistema interno di riparoche
riconosce nel plasmide il mismatch.
PCR per la mutagenesi sito diretta
Usata se vogliamo mutare in modo specifico alcune basi della nostra
soluzione da amplificare. È basata su oligo a sequenza nota
in cui le mutazioni sono state introdotte in posizioni predeterminate.
È utile per cambiare la sequenza che codifica per un determinato
aminoacido (codone). Prima della PCR esistevano tecniche di mutagenesi
basate sullo stesso principio.
1) Mutagenesi all’estremita’
dell’amplificato.
Introduzione di siti di restrizione utili al clonaggio successivo
o per fare fusioni geniche (Voglio fondere A e B, A ha un sito ottimale,
B no).
La PCR ci viene incontro perché ci permette di amplificare
il pezzo di gene che vogliamo fondere mettendogli all’estremità
un sito per un enzima di restrizione compatibile con quello dell’altro
gene.
2) Mutagenesi all’interno dell’amplificato.
Uso PCR con “piedini adesivi” (sticky feet)
Amplifico con PCR il DNA da inserire in un gene clonato usando oligo
con le ali.
Le ali sono rappresentate da nucleotidi aggiungoizzionali complementari
al DNA del gene clonato, posto al confine del tratto in cui inserire
il nuovo pezzo di DNA.
Denaturo il frammento amplificato per ottenere la singola elica
e la ibrido con il vettore a ssDNA contenente Uracile.
Estensione e ligazione.
Trasformazione di E.coli Ura+ e isolamento del DNA mutante.
Se il vettore iniziale è un vettore d’espressione posso
cercare di capire come il pezzo di DNA inserito influenzi la funzionalità
della proteina.
Metodologie diverse a seconda che sia una sequenza
molto piccola o molto estesa
È come se avessimo 2 oligo vicini, connessi da un ponte che
non si appaia.
Disegno di oligo. Una delle metodologie prevede il disegno di 2
oligo. Ogni oligo no comprende tutta la sequenza da inserire, ma
solo un pezzo: un pezzo della sequenza da inserire e un pezzo della
sequenza originale. Quello da inserire è scelto in maniera
particolare: uno è comune a tutti e due gli oligo, in modo
che si possano appaiare (è complemetare). Sono messi imodo
tale per cui un enzima sceglie un oligo e va appaiare anche l’altro.
Ora faccio due reazioni di PCR, non li uso assieme dall’inizio:
uso un oligomutagenico più un altro oligo completamente omologo
alla sequenza da mutare. lo scegliamo inmoo che, formando 2 coppie
(1 oligo mutagenico + 1 oligo omologo) ci permetta di avere metà
della sequenza con inserzione della basi all’estremità.
stessa cosa la facciamo con l’altra coppia. Con le 2 coppie
faccio 2 reazione completamente separate, avrò: metà
della copia del templato con mutazione all’estremità.
L’altra reazione ci dà l’altra metà con
l’altro pezzo di mutazioni. Abbiamo quindi diviso l’inserzione
in 2 parti: inseriamo in pezzo in un amplificato e un pezzo nell’altro
amplificato. La caratteristica dei 2 pezzi è il loro self
appaiamento: mischio le 2 metà mischiando il prodotto della
reazione A con il prodotto della reazione B. Mischiandole, denaturo,
faccio avvenire l’annealing con le estremità (che coincidono
con gli oligo disegnati all’inizio). [notare bene l’orientamento
dei 2 filamenti che si appaiono solo 5’–>3’:
con l’orientamento invertito la polimerasi non può
fare assolutamente niente] Ora le polimerasi procedono e completano
il ds. Ottengo una copia del templato di partnza più il templato
che ho inserito (quella zona in più). D’ora in poi,
utilizzando gli oligo alle estremità ottengo l’ampli
del templato più il pezzo aggiunto.
Il vantaggio è che tutto questo lavoro si fa un un giorno.
Modificando il templato di partenza ci vuole un mese.
