-1° Giorno-
Determinazione della concentrazione di DNA in soluzione attraverso
metodi spettrofotometrici
Protocollo:
Si determinerà la concentrazione di una soluzione di DNA
relativo al vettore di clonaggio pGEM7zf, precedentemente purificato
in grande quantità. Si userà sia la spettrofotometria
begli ultravioletti (UV) che la valutazione
effettuata dopo elettroforesi in gel d'agarosio.
Impostare lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 260 nm.
- In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco)
e azzerare lo strumento.
- Preparare una cuvetta di quarzo contenente 698ul
di H20 e qaggiungere 2ul della soluzione di DNA plasmidico
(diluizione 1:350).
- Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo
delicatamente la cuvetta.
- Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza
(A) a 260 nm.
- Tornare sul bianco spostare la lunghezza d'onda a 280nm. Azzerare
lo strumento.
- Passare al campio e leggere l'A280.
- Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA sapendo
che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento
alla concentrazione di 50ug/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm:
| Concentrazione DNA /ug/ml)=A260nm |
x |
50ug/ml |
|
| 1 Unità assorbimento |
- Per risalire alla concentrazione iniziale della soluzione moltiplicare
il valore ottenuto per il fattore di diluizione (x350)
- Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale rapporto
dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura di DNA. Se
il rapporto è < di 1.7 significa che è presente
una contaminazione da parte delle proteine.
- Partendo dal valore calcolato, preparare una soluzione di 10ul
di DNA plasmidico alla concentrazione di 150 ng/ul diluendo con
tampone TE [Tris HCl 10mM, EDTA 1mM pH8]
Note, risultati e conclusioni:
L'entità dell'assorbimento varia in funzione della natura
del DNA, infatti DNA denaturato assorbe di più.
In particolare l'assorbanza (A) è in proporzione alla concentrazione,
come descritto dalla legge di Lambert-Beer (che è valida
solo per luce monocromatica).
| A260nm |
A280nm |
| 0.092 |
0.057 |
Con coefficiente di purezza = A260/A280 = 1.614
Dove se questo valore è maggiore o uguale a 1.7 si a una
preparazione pura di DNA, altrimenti è presente una contaminazione
proteica.
Microbiologia
